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1.Ghrelin促进大鼠心肌微血管内皮细胞体外血管生成的研究 2.冠心病患者血浆ghrelin水平及其基因多态性的研究

王丽  
【摘要】:目的:探讨生长激素促分泌物受体的内源性配体ghrelin对大鼠心肌微血管内皮细胞增殖、迁移及Matrigel小管样结构生成的影响。 方法:(1)植块法分离成年SD雄性大鼠的心肌微血管内皮细胞, VIII因子免疫组织化学鉴定细胞种类并传代培养;(2)通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫荧光、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹法(Western-blot)鉴定ghrelin及其天然受体(growth hormone secretagogue receptor, GHSR)在心肌微血管内皮细胞上的mRNA及蛋白表达;(3)用不同浓度(10~(-9)~10~(-6)M)的ghrelin干预心肌微血管内皮细胞后,BrdU ELISA和BrdU荧光染色测定细胞增殖、Transwell测定细胞迁移及Matrigel培养测定细胞小管样结构的生成,观察ghrelin对心肌微血管内皮细胞增殖、迁移及Matrigel小管样结构生成的影响。 结果:(1)植块法培养的原代心肌微血管内皮细胞,细胞纯度达95%左右,且具有形成管腔样结构的能力。(2)RT-PCR、免疫荧光、ELISA和Western-blot检测发现ghrelin及生长激素促分泌物受体(GHSR)在心肌微血管内皮细胞上均有表达。(3)分别用10~(-9M~10~(-6)M的ghrelin干预心肌微血管内皮细胞后,发现10~(-8)、10~(-7)M ghrelin处理组心肌微血管内皮细胞的增殖、迁移及Matrigel小管样结构的生成明显高于正常对照组(P<0.05),而更高浓度10~(-6)M ghrelin较正常对照组却显著抑制了心肌微血管内皮细胞的增殖、迁移及Matrigel小管样结构的生成(P<0.05)。 结论:Ghrelin及其受体GHSR在大鼠心肌微血管内皮细胞上均有表达,10~(-8)、10-7M ghrelin可明显促进大鼠心肌微血管内皮的增殖、迁移及Matrigel小管样结 构的生成。 目的:探讨生长激素促分泌物受体的内源性配体ghrelin促进大鼠心肌微血管内皮细胞增殖、迁移及Matrigel小管样结构生成的分子机制。 方法:(1)分别用10~(-9)M~10~(-6)M ghrelin孵育心肌微血管内皮细胞15min后,或10-7M ghrelin孵育细胞0~60min后,收集细胞Western-blot检测ERK、Akt和eNOS磷酸化表达的变化。(2)分别用ERK、Akt、eNOS和GHSR1a的特异性抑制剂PD98059、LY294002、L-NAME和[D-Lys3]-GHRP-6预处理心肌微血管内皮细胞30min,再用ghrelin孵育细胞15min后,收集细胞Western-blot检测其ERK、Akt和eNOS磷酸化表达的变化。(3)分别用ERK、Akt、eNOS和GHSR1a的特异性抑制剂PD98059、LY294002、L-NAME和[D-Lys3]-GHRP-6干预心肌微血管内皮细胞后,检测ghrelin对心肌微血管内皮细胞增殖、迁移和Matrigel小管样结构生成的影响,及其一氧化氮生成的变化。 结果:Ghrelin可呈时间和剂量依赖性的促进心肌微血管内皮细胞ERK、Akt和eNOS的磷酸化表达。Ghrelin在促进心肌微血管内皮细胞体外血管生成的同时伴有ERK、Akt和eNOS的磷酸化表达,及其一氧化氮的释放增加。GHSR-1a的特异性抑制剂[D-Lys3]-GHRP-6可完全抑制ghrelin促心肌微血管内皮细胞体外血管生成效应、磷酸化蛋白的表达及其一氧化氮的释放增加。ERK的特异性抑制PD98059可显著抑制ghrelin诱导的心肌微血管内皮细胞ERK磷酸化表达及其促血管生成效应,但对Akt和eNOS的磷酸化表达无影响。Akt的特异性抑制剂LY294002可显著抑制 ghrelin诱导的Akt和eNOS磷酸化表达、促血管生成效应及其一氧化氮的释放,但对ERK的磷酸化表达无影响。eNOS的特异性抑制剂L-NAME可显著抑制ghrelin诱导 的eNOS磷酸化表达、促血管生成效应及其一氧化氮的而释放,但对ERK和Akt的磷酸化表达无影响。 结论:Ghrelin可通过激活GHSR1a依赖的MEK/ERK和PI3K/Akt/eNOS/NO信号 途径促进大鼠心肌微血管内皮细胞增殖、迁移及Matrigel小管样结构的生成。 目的:探讨冠心病患者血浆ghrelin水平改变及其ghrelin基因Leu72Met(C408A)、Arg51Gln(G346A)两个SNP位点的分布情况。 方法:(1)采集316例冠状动脉造影患者的主动脉窦、左右冠状动脉开口处的动脉血,放免法测定血浆ghrelin水平。(2)聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法,进行ghrelin基因C408A和G346A的多态性分析。 结果:(1)冠心病组的血浆ghrelin水平较正常对照组明显减低(P<0.05);冠心病组中血浆ghrelin水平与各变量相关性分析显示动脉血浆ghrelin水平与腰臀比及体重指数呈负相关,多元逐步回归分析显示,腰臀比和体重指数是影响冠心病患者血浆ghrelin水平的独立相关因素。(2)Ghrelin基因C408A多态性分析,冠心病组的基因型分布及等位基因频率与正常对照组相比差异无统计学意义。且分别在两组中对不同基因型的血浆ghrelin水平比较,差异亦无统计学意义(P>0.05)。进一步分析提示,CA+AA基因型的血浆HDL-C水平均较同组CC基因型者降低(P<0.001);在所有受试者中均没有发现G346A多态性存在。 结论:冠心病患者中血浆ghrelin水平降低,ghrelin基因C408A多态性与血浆ghrelin水平无关,C408A多态性与血浆HDL-C水平相关,本组人群中未发现G346A多态性存在。


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