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NFATc1自身抗体及其抗原在上皮性卵巢癌的初步研究

龙丽  
【摘要】:目前卵巢癌高死亡率的原因主要是由于缺乏早期特异性标志物而不能及时诊断,肿瘤自身抗体产生于疾病的极早期,对早期恶性肿瘤的诊断具有特异性和敏感性。在前期实验中,我们应用反向捕获抗体芯片技术筛选出19种上皮性卵巢癌特异性自身抗体,其中NFATc1自身抗体表达水平最高,并且其抗原是一个潜在的癌基因,但目前国内外尚无该自身抗体及其抗原在卵巢癌的相关报道。卵巢癌80-90%属于上皮来源,因此本课题拟对NFATc1自身抗体在上皮性卵巢癌的检测特异性,敏感性及其与CA125的组合检测效率进行进一步研究,并对其抗原NFATc1在上皮性卵巢癌的表达,功能和机制进行初步探索。以期及早发现上皮性卵巢癌、进一步了解其发生发展机制、提高患者生存率及生存质量。本研究分为以下3个部分完成: 第一部分: NFATc1自身抗体及其联合CA125在上皮性卵巢癌的检测效率。 收集2010年1月至2011年6月重庆医科大学附一院妇产科因“卵巢肿瘤”入院的住院患者156例(包括上皮性卵巢癌82例,其中Ⅰ、Ⅱ期(早期)患者28例,Ⅲ、Ⅳ期(晚期)患者54例;卵巢良性肿瘤(浆液性囊腺瘤及粘液性囊腺瘤)35例;卵巢子宫内膜异位囊肿39例),所有对象均清晨空腹静脉采血,常规分离血清,-40℃保存。用ELISA间接法检测每例血清NFATc1自身抗体的表达水平,并对其早晚期检测特异性,敏感性,以及与CA125联合检测效率进行分析。 实验结果显示上皮性卵巢癌患者血清NFATc1自身抗体水平明显高于其他三组(P 0.01),并且早晚期的表达水平有统计学差异;正常对照组和卵巢良性疾病组(卵巢良性肿瘤及卵巢子宫内膜异位囊肿),卵巢良性肿瘤和卵巢子宫内膜异位囊肿两组间的表达无统计学意义(P0.05);高等学校博士学科点专项科研基金(基金号:200806310001) 当切割值为P/N≥2.1时,上皮性卵巢癌早晚期的阳性病例数分别为22例及39例,良性肿瘤,卵巢内膜异位囊肿及正常对照组分别有4例,4例及7例,恶性组和良性疾病,正常人群的病例数存在较大的差异。当切割值为P/N≥2.1时,对早晚期卵巢癌均有较好的诊断价值,早期卵巢癌诊断敏感性为78.6%,特异性为85.4%,阴性预测值为87.2%,阳性预测值为75.9%,诊断效率82.9%;晚期卵巢癌的各类诊断价值分别为72.2%,85.4%,73.2%,84.8%,78.4%,对早期卵巢癌的诊断似乎更有优势。 联合分析血清NFATc1自身抗体和CA125的诊断价值,以二者其中之一高于参考值即视为阳性,早晚期诊断特异性可达92.4%﹑93.3%,检测的敏感性为:86.9%﹑91.6%,诊断效率:88.2%。均高于单独检测其中的任意一项。 第二部分: NFATc1抗原在上皮性卵巢癌SKOV3细胞及裸鼠移植瘤模型的表达及功能研究。 收集2009至2011年重庆医科大学附一院病理科组织标本156例行免疫组织化学实验,其中上皮性卵巢癌78例,卵巢良性肿瘤(浆液性囊腺瘤及粘液性囊腺瘤)32例,卵巢子宫内膜异位囊肿46例。分别对各组病例行免疫组织化学实验,检测NFATc1抗原表达水平。 从细胞及动物水平观察NFATc1的基因和蛋白表达水平:人上皮性卵巢癌细胞株SKOV(3浆液性乳头状囊腺癌系)由重庆医科大学分子医学与肿瘤中心惠赠,4-8周龄雌性裸鼠由重庆医科大学动物实验中心提供,并建立裸鼠移植瘤模型,用Real time PCR、Western blot方法检测NFATc1siRNA作用前后的SKOV3细胞和移植瘤癌组织中NFATc1基因和蛋白表达水平。 从细胞及动物水平观察NFATc1对上皮性卵巢癌恶性生物学行为可能的影响。细胞水平:分别用MTT,流式细胞检测术,Transwell侵袭小室及划痕试验检测NFATc1siRNA作用前后SKOV3细胞的增殖,凋亡,侵袭及迁移情况;动物水平:建立人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,观察成瘤情况,并对NFATc1siRNA作用前后的移植瘤重量,体积和抑制率进行比较。 实验结果显示如下: NFATc1抗原在上皮性卵巢癌高表达:NFATc1表现为棕黄色颗粒,定位于细胞质。阳性表达于75例(96%)上皮性卵巢癌,HScore半定量法的平均积分为269(0-356);阳性表达于6例(18.75%)卵巢良性肿瘤,HScore平均积分为75(0-180);阳性表达于8例(17%)卵巢子宫内膜异位囊肿,HScore平均积分为85(0-185);NFATc1在上皮性卵巢癌的表达明显高于另外两类卵巢良性病变(p0.05) NFATc1mRNA表达水平(NFATc1siRNA作用前后):细胞水平:干扰组NFATc1的mRNA相对表达量为0.5333±0.0208,与空白对照组比较P=0.000,具有统计学意义。动物水平:干扰组NFATc1的mRNA相对表达量为0.1896±0.0324,与空白对照组比较P=0.000,差异具有统计学意义。 NFATc1蛋白表达水平(NFATc1siRNA作用前后):细胞水平:各组细胞在相应位置均出现91KD的NFATc1条带,但强弱不一,空白组和阴性对照组条带较亮,NFATc1si RNA组表达最弱,与前两组比较差异具有显著性(P0.05);动物水平:各组肿瘤组织在相应位置均出现91KD的NFATc1条带,但强弱不一,空白组和阴性对照组条带较亮,NFATc1si RNA组表达最弱,与前两组比较差异具有显著性(P0.05)。 降低NFATc1的活性可抑制SKOV3细胞生长:NFATc1siRNA干扰以后,SKOV3细胞的生长受到抑制,结果显示随着作用时间的延长,其抑制效能亦逐渐增强,以48小时抑制效率最高。 降低NFATc1的活性可促进SKOV3细胞凋亡:通过流式细胞仪检测各组SKOV3细胞的凋亡率,SKOV3细胞对照组的凋亡率为(3.78±0.24)%,而NFATc1siRNA组细胞的凋亡率为(6.98±0.23)%;2组细胞的凋亡率差异具有统计学意义(p=0.000),即NFATc1siRNA可促进SKOV3细胞凋亡。 降低NFATc1的活性可降低SKOV3细胞迁移和侵袭能力:划痕实验结果显示,各组SKOV3划痕后在24小时,48小时的时间点,NFATc1siRNA组划痕愈合速度明显低于空白组和阴性对照组,分别与后两组比较有统计学意义,空白组和阴性对照组未见明显差异。空白组和阴性对照组侵出小室的SKOV3细胞数(115±16;111±18)较NFATc1siRNA组(39±7)明显偏多,空白组和阴性对照组比较无明显差异,它们分别与干扰组相比较时具有显著的统计学意义(P 0.05)。 降低NFATc1的活性可抑制裸鼠移植瘤生长:18只裸鼠接种肿瘤成功率为100%,空白对照组和阴性对照组潜伏期约6-8天,NFATc1siRNA干扰组潜伏期约8-11天。肿瘤在局部呈膨胀性生长,2~3周后体积逐渐增大。NFATc1siRNA干扰组抑瘤率为57.08%,且重量和体积均小于两个对照组,比较有统计学意义。 第三部分:NFATc1对上皮性卵巢癌脉管生成的影响及其可能机制研究。 建立人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,分别用CD34、Podoplanin标记NFATc1siRNA作用前后移植瘤癌组织的微血管,微淋巴管并计数。RT-PCR, Western blot检测NFATc1siRNA作用前后SKOV3细胞和移植瘤癌组织CXCR2, FGF-2和PDGF BB表达水平。 实验结果显示如下: 干扰NFATc1的活性可抑制裸鼠移植瘤组织血管及淋巴管生成:CD34染色观察瘤组织血管生成情况, Podoplanin染色观察瘤组织淋巴管生成情况:CD34特异性地表达在移植瘤组织毛细血管内皮细胞的胞质,Podoplanin染色标记微淋巴管为棕黄色管腔。空白组和阴性对照组微血管密度(12.00±1.65,11.47±0.32);微淋巴管密度(10.03±0.96,9.95±1.12),明显多于干扰组(5.36±0.34,4.67±0.26),差异有统计学意义。 干扰NFATc1的活性可抑制CXCR2,FGF-2和PDGF BB mRNA的表达:琼脂糖凝胶电泳结果显示,扩增的各组NFATc1,CXCR2,FGF-2和PDGF BB基因电泳带存在明显差异。其中,空白组和阴性对照组扩增带亮度较强;NFATc1siRNA组扩增带亮度较弱,用Quantity one凝胶成像系统分析NFATc1,CXCR2,FGF-2和PDGF BB和内参照β-actin的灰度值,计算它们分别的光密度比值,与两个对照组比较,差异均具有显著性(P<0.05)。证实了NFATc1siRNA可以在mRNA水平上明显抑制上述4种基因转录。 干扰NFATc1的活性可抑制CXCR2,FGF-2和PDGF BB蛋白的表达:各组细胞在相应位置出现NFATc1, CXCR2,FGF-2和PDGF BB条带,但强弱不一,空白组与阴性对照组OD值最强,分别为:0.907±0.001,0.926±0.005,0.865±0.005,0.931±0.003;0.827±0.005,0.913±0.003,0.907±0.001,0.893±0.005。干扰组表达最弱,分别为0.295±0.003,0.382±0.001,0.396±0.001,0.318±0.003。各组与干扰组比较差异具有显著性(P0.05)。 结论 首次发现NFATc1自身抗体及其抗原在上皮性卵巢癌有特异性表达。NFATc1自身抗体联合CA125有可能成为早期上皮性卵巢癌特异性组合标志物。NFATc1抗原在上皮性卵巢癌的高水平表达能促进其恶性生物学行为,并且很可能通过肿瘤血管及淋巴管生成实现。本研究为上皮性卵巢癌的早期诊断、治疗方案、分子机制以及进一步扩大样本量和临床试验提供了一定的理论基础。


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