粉防己碱对血管性痴呆大鼠星形胶质细胞的炎性作用机制的研究

【摘要】：目的：血管性痴呆（Vascular dementia,VaD）是由于脑血管疾病导致的认知功能障碍临床综合征。VaD的发病机制尚不明确，但是以神经胶质细胞的激活和促炎因子的释放为特征的神经炎性机制在疾病的发生、发展中占有极其重要的地位。S100B蛋白是一种酸性钙结合蛋白，主要由星形胶质细胞合成和分泌，常作为胶质细胞激活的标志。粉防己碱（Tetrandrine，Tet）是从中药防己科植物粉防己根中提取的双苄基异喹啉类生物碱，是天然的钙通道阻滞剂，并具有消炎镇痛的作用，已被广泛应用到心血管系统和炎性疾病的防治中。但Tet用于VaD的研究目前还未见报道。本研究采用双侧颈总动脉永久性结扎制作大鼠VaD模型，观察Tet对模型大鼠行为学及组织病理学改变的影响，检测海马内神经胶质的激活标志物（S100B）和炎症因子（IL-1β、iNOS）的释放，以期揭示Tet对VaD大鼠的神经保护机制，从而为VaD的临床治疗提供新的实验依据. 方法： 1.采用双侧颈总动脉结扎术（2-VO）建立缺血性血管性痴呆大鼠模型，8周后所有大鼠行Morris水迷宫定位航行试验，记录逃避潜伏期，按照文献计算百分比，筛选VaD大鼠模型，合格者选入下一步试验。 2.不同浓度的Tet（10mg/kg和30mg/kg）腹腔注射，3次/周，连续给药4周。造模12周后进行Morris水迷宫实验检测大鼠行为学，HE染色、尼氏染色观察海马CA1区神经元组织病理学变化，利用TUNEL原位末端标记法检测海马神经元凋亡情况。揭示Tet对VaD大鼠的学习记忆能力和病理学损伤的影响。 3.各组大鼠过量麻醉处死后，提取海马组织总mRNA和蛋白质，通过FQ-PCR和Western Blot检测海马组织内IL-1βmRNA和S100B mRNA的表达量以及iNOS和S100B蛋白的表达量；同时留取石蜡切片，运用免疫荧光组织化学染色方法观察海马CA1区S100B的表达情况；将海马组织匀浆化，用Fluo-3/AM探针负载后检测各组大鼠海马内[Ca2+]i浓度变化。探讨Tet改善VaD大鼠神经功能的可能分子机制。 结果： 1.双侧颈总动脉结扎术后，大鼠出现明显的反应迟钝，活动减少。经计算逃避潜伏期百分比，大鼠痴呆比率为83%。 2. Morris水迷宫试验显示：Tet干预治疗后，VaD大鼠的平均逃避潜伏期明显缩短（P0.05），穿越平台次数明显增多（P0.05），目标象限路程明显延长（P0.05）。HE染色、尼氏染色显示：Tet干预组大鼠海马CA1区锥体细胞病理改变较模型组有明显改善，同时神经元内尼氏小体也较模型组显著增多。Tet干预组海马CA1区神经元凋亡数目较模型组明显减少（P0.05）。TUNEL原位末端标记法显示：Tet干预组海马CA1区神经元凋亡数目较模型组明显减少（P0.05）。 3.通过FQ–PCR、Western blot、免疫荧光检测显示，2-VO法可诱发大鼠海马CA1区星形胶质细胞内S100B的激活，海马细胞内S100BmRNA和S100B蛋白的表达增高（P＜0.05），炎症因子IL-1β和iNOS的表达量也显著升高（P＜0.05）；而Tet治疗组海马内升高的S100B、IL-1β和iNOS水平表达明显降低（P＜0.05）。Fluo-3/AM探针检测发现，与模型组相比，Tet治疗组大鼠海马[Ca2+]i浓度显著下降(p0.05)。 结论： 1.采用2-VO法诱发全脑慢性缺血成功的建立了缺血性VaD大鼠模型，该模型死亡率低而痴呆发生率高。 2. Tet显著改善慢性脑缺血损伤引起的学习记忆能力障碍和病理损伤，减少海马CA1区神经元凋亡，对VaD大鼠发挥明显的保护作用。 3. Tet通过抑制胶质细胞的激活下调星形胶质细胞内S100B的表达，减少促炎因子IL-1β和iNOS释放，从而抑制VaD海马内慢性炎性反应引起的脑损伤。