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苛求芽孢杆菌尿酸酶的结构对其热稳定性的影响

冯娟  
【摘要】:重组苛求芽孢杆菌(ATCC29604)胞内尿酸酶用于动力学方法测定血清尿酸有显著优势,还有治疗高尿酸血症的药用潜力。本实验室构建N端序列为AERTMFYGKGDV的重组尿酸酶,其米氏常数为(0.22±0.01)mM,初速度法不适合测定其动力参数;此重组尿酸酶在pH7.4的稳定性半衰期约7小时,且四聚体结构不稳定。本文首先建立了重组苛求芽孢杆菌尿酸酶动力学参数的评价方法,考察了不同条件下重组表达的尿酸酶的四聚体结构变化,分析了其单位结构模型的活性中心及其附近静电作用网络,优化此静电网络及N端第1到9位残基、C端296到322位残基,构建了N端、中间点突变体及C端截短共12个突变体,并表征了所构建突变体的性质,探索N端、C端序列与此重组表达尿酸酶热稳定性和高级结构的关系。 1.重组表达尿酸酶动力学参数评价方法的建立 通过初速度法测定了Tris-HCl和硼砂缓冲液中的酶中间产物5-羟异尿酸的干扰,用0.103U的酶量,300μM的尿酸反应,308nm下测定,在Tris-HCl缓冲液中的5-羟异尿酸的积累较硼砂缓冲液中的严重,pH7.4较pH9.2的严重,200μM的Mg2+加速5-羟异尿酸的分解。尿酸对二甲基酚橙法测定尿酸酶米氏常数在Tris-HCl缓冲液中有负干扰,在硼砂缓冲液中有正干扰,可能是由于Fenton反应产生羟自由基会诱发尿酸氧化而造成二价铁离子氧化,但加入消除羟自由基的0.5M甘露醇和0.5M甲酸钠并不能消除干扰。通过初速度法测定308nm吸收时,随着加入酶量降低中间产物积累的干扰减弱,测得pH7.4,8.2and9.2的Km分别逐渐趋于0.17±0.02mM (n=3),0.34±0.02mM (n=3),0.35±0.01mM(n=3)。因分析反应过程对起点的不确定度有抗性,采用积分法测定黄嘌呤和氧嗪酸钾的Ki。初速度法测定尿酸为75μM,300μM,600μM时,酶的最适温度为分别为10℃、20℃、20℃。二甲基酚橙法测定尿酸浓度为75μM,300μM,600μM时最适温度分别为10℃、20℃、30℃。可能由于有熵效应的存在,此尿酸酶的最适温度在30℃。几种方法测得其最适pH值均在9.0附近。 2.不同条件下N端为AERTMFYGK重组尿酸酶的四级结构变化 ﹣20℃冻存3个月以后造成重组尿酸酶四聚体结构逐渐解聚为二聚体,伴随着酶的比活性降低,﹣20℃冻存6个月的样品主要以二聚体为主。在37℃,pH7.4和9.2的硼砂缓冲液中当其比活性降为原来的1/10以下时,可溶性部分仅有四聚体,而体系出现肉眼可观察到的不溶性沉淀;非变形PAGE分离所得四聚体仍然保留催化活性,但其比活性降低;新鲜制备的此重组尿酸酶在pH7.4的半衰期为50h,但冻存后明显缩短。 3.配体增强N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶热稳定性 非变性PAGE分析发现此重组表达尿酸酶低温冻存后形成二聚体;经400μM尿酸,120μM黄嘌呤或30μM氧嗪酸钾诱导之后转变为有活性的四聚体,且经亲和力较强的氧嗪酸钾作用之后,重组表达的尿酸酶在pH7.4的的半衰期可延长到150个小时左右。 4.苛求芽孢杆菌N端C端结构对其稳定性的影响 据已有N端为AERTMFYGK的基因序列的重组表达载体的同源建模的模型,分析了活性中心及其附近静电作用网络,优化此静电网络及N端第1到9位残基、C端296到322位残基,构建系列N端、中间点突变体及C端截短共12个突变体,设计合成突变引物进行PCR反应,克隆突变体。N端7个突变体重组表达尿酸酶比较发现N端序列对其Ki、Km及最适温度和最适pH影响较小,而前三个氨基酸对其比活性和稳定性影响显著:其中N端突变体ADD,SQR,QQG的比活性分别为0.01U、1.64U、0.153U,经非变性PAGE电泳可见以二聚体为主,而N端为QER,QQR,VQR的比活性分别为7.0U、7.2U、9.3U,经非变性PAGE电泳可见以四聚体为主,QER,QQR,VQR在pH7.4的体外半衰期分别为350,450,200小时左右,N端前三个氨基酸对其比活性及结构稳定性起重要作用,N端的ADD,ARR突变体去除C端12个氨基酸后其比活性只有天然酶的0.1%左右,C端对尿酸酶催化活性起重要作用,突变体VQR比活性在所测定突变体中最高,达到9.3U/mg,略低于原来N端为AERT者。


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