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高强度聚焦超声联合载HSV1-TK自杀基因超声微泡造影剂治疗肝癌的实验研究

周世骥  
【摘要】:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)在我国发病率高,危害性大,目前仍以手术为主的综合治疗,虽然外科手术如肝叶切除或肝脏移植,能提供一个较好的远期预后,但诸多因素使得适合和接受手术者仅为20%左右。近十年来,HCC局部治疗手段,特别是高强度聚焦超声(High intensity focused ultrasound, HIFU)的应用愈发广泛,因其适应证宽,对患者全身情况要求不高,对巨块型,多结节型肝癌均可治疗并能取得了较好的疗效,目前已成为最有前途的肝癌辅助治疗方法之一。但因诸多因素如肋骨遮挡、呼吸运动、肿瘤丰富的血供等影响,使得HIFU在治疗肝癌时存在肿瘤组织残存的缺陷。为了解决这一难题,目前使用的方法即联合其他的治疗手段如联合化疗、基因治疗、介入等,以弥补该方法的缺陷,使HIFU治疗肝癌更加的彻底。 目前肝癌的基因治疗根据肝癌的发病机制分为免疫基因治疗、抑癌基因治疗、反义基因治疗、自杀基因治疗、抗肿瘤血管生成基因治疗、多药耐药基因治疗等,而自杀基因疗法尤其是其中单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/更昔洛韦(Herpes simplexvirus type1thymidine kinase/Gancyclovir, HSV1-TK/GCV)自杀基因治疗系统成为了目前肝癌基因治疗中最有前途的治疗方法之一。 HSV1-TK/GCV自杀基因系统作为肝癌基因治疗的手段之一,其主要是通过TK蛋白将无毒的前药GCV经过多次磷酸化转变成细胞毒性的三磷酸化合物(Ganciclovir triphosphate, GCV-TP), GCV-TP能抑制DNA聚合酶活性,阻止DNA自我复制,从而杀灭肿癌细胞;同时该系统还能将毒性产物通过细胞间隙连接或直接分泌到细胞外,通过诱导癌细胞凋亡或免疫介导等途径杀死周边未被转染的瘤细胞而发挥“旁观者效应”,而与其他治疗基因一样,外源基因载体系统的选择成为基因治疗亟待解决的问题之一。 目前基因载体系统包括两大类,即病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等,其主要优点为转染效率高,但是其安全性有待进一步提高;非病毒载体包括脂质体、质粒DNA等,其优点是安全性较高、可反复利用,但是其转染效率较低、缺乏主动靶向性,因而限制其临床应用。 超声靶向微泡破坏(Utrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技术是新近出现的一种基因或药物靶向递送系统。该技术通过体外超声靶向破坏经血液循环到靶组织携带有药物或外源基因的超声微泡造影剂使药物或外源基因靶向释放,实现药物或治疗基因的靶向递送。当超声波击碎超声微泡时产生的空化效应能使肿瘤毛细血管通透性增高,增加血管内皮间隙使外源基因更容易进入肿瘤组织内,提高了外源基因的转染率,同时该技术使用的低频超声不但不会对外源基因产生任何破坏,还能增加外源基因的转染率,从而提高基因治疗肿瘤的效果。超声微泡合成材料为脂质材料,脂溶性好,对生物体的安全性高且低免疫原性,可重复使用。而超声微泡造影剂作为基因载体的同时本身具备超声造影的功能,能提高肝癌的检出率,提高治疗基因的靶向性和精准性。 基于上述超声靶向微泡破坏技术的各种优势,本课题通过制备载HSV1-TK自杀基因超声造影剂,将其应用于H22小鼠肝癌皮下移植瘤模型中观察其靶向性及治疗效果,同时为了进一步观察其联合HIFU治疗效果,将HIFU联合载HSV1-TK基因超声微泡治疗VX2肝癌,观察联合治疗效果及HSV1-TK/GCV自杀基因系统的作用机理,为HIFU和基因联合治疗肝癌方面提供可靠的实验依据。 本课题研究内容主要包括以下三个部分: 第一部分载HSV1-TK基因脂质超声微泡造影剂的制备 目的:构建携HSV1-TK自杀基因质粒并实现超声微泡造影剂与HSV1-TK基因的连接,评价其物理性质、携带基因的能力及体内显影效果。方法:通过选用真核表达载体pIRES2-EGFP和TK通过酶切、PCR扩增、重组、鉴定、测序合成pIRES2-EGFP-TK;采用静电吸附原理将TK基因吸附于自制的超声微泡造影剂上,检测微泡的大小、分布、电荷、形态、携基因量及体内显影效果。结果:重组质粒经酶切及PCR反应后电泳结果显示约1024bp附近有一特异条带,与目的基因的长度相近,测序鉴定结果与Genbank中序列相比对完全一致;载基因微泡粒径大小、分布情况、电荷情况均满足超声造影剂的要求;内体造影效果显示,载基因微泡能明显增强小鼠H22肝癌的显影,且持续时间较长,约25min。结论:成功构建pEGFP-TK质粒并实现了自制超声微泡造影剂与目的基因之间的连接,同时还实现了体内的造影需求,为后续的实验奠定了较好的基础。 第二部分超声辐照微泡介导HSV1-TK自杀基因治疗小鼠肝癌的实验研究 目的:观察超声辐照介导的单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因(HSV1-TK)在小鼠肝癌细胞H22移植瘤组织中的表达情况及结合前药更昔洛韦(GCV)后对肿瘤的杀伤效果。方法:建立小鼠肝癌(H22)皮下移植瘤模型40只,随机分成四组,即A.对照组(PBS);B.单纯质粒组(HSV1-TK);C.质粒+超声辐照组(HSV1-TK+US)④质粒+超声辐照+微泡组(HSV1-TK+US+MB)。分别经鼠尾静脉注入PBS、HSV1-TK、HSV1-TK、HSV1-TK+微泡,每次注射200μl,每隔3d注射一次,共注射3次,C、D组分别给予1MHz,2W/cm~2,5min超声辐照,48h后各治疗组分别经腹腔注射GCV0.2ml(100mg·kg~(-1)·d~(-1))连续注射14天。48h后活杀一批荷瘤鼠采用Western-blot检测肿瘤组织中TK蛋白的表达情况,监测肿瘤大小及生存时间,分别绘制肿瘤生长曲线及生存曲线图,检测肿瘤细胞凋亡情况及生物学形态。结果:治疗组中均有TK蛋白的表达,其中D组表达量明显高于其他各组(P0.05);各组荷瘤鼠经治疗后A组、B组、C组、D组抑瘤率分别是0%,3.90%±1.80%,22.70%±2.86%,41.25%±3.20%。四组肿瘤体积比较,D组与其他各治疗组比较抑瘤效应更加明显,且D组与C组LSD-t=161.29,P0.05;D组与B组LSD-t=323.71,P0.01;C组与B组LSD-t=162.43,P0.05;A组与B组LSD-t=28.96,P0.05;从生存时间曲线图可以看出微泡载基因组能明显改善荷廇鼠的生存时间;TUNEL染色D组肿瘤细胞凋亡指数明显比其他各组高(P0.05);HE染色D组较A组坏死病变明显。结论:超声破坏包裹HSV1-TK基因的微泡定位释放,即增加了肝癌基因治疗的靶向性,又提高了外源基因的转染率,从而增强了自杀基因对小鼠肝癌的杀伤效果,这为肝癌的基因治疗提供了一个新的策略。 第三部分高强度聚焦超声联合载HSV1-TK自杀基因超声微泡治疗VX2兔肝癌的实验研究 目的:探讨联合载HSV1-TK自杀基因超声微泡能否增强高强度聚焦超声(HIFU)治疗肝癌的杀伤效果。方法:建立75只VX2兔肝癌模型,随机分成①HIFU治疗组;②HIFU+HSV1-TK组;③HIFU+HSV-TK+US组;④HIFU+HSV-TK+US+MB组;⑤HSV-TK+US+MB组。前四组均行HIFU治疗,治疗参数:频率1.0MHz,焦距156mm,辐照声功率150W。HIFU治疗结束后,分别经新西兰大白兔耳缘静脉注射生理盐水、HSV1-TK、HSV1-TK+MB,注射完后使用超声基因转染仪进行辐照,辐照参数为300KHz,2W/cm~2,辐照方式为脉冲式,即辐照10s,间歇10s,持续20分钟。辐照结束24h后开始经荷瘤兔后腿肌注前药GCV,剂量为100mg·kg~(-1)·d~(-1),持续注射10d。转染HSV1-TK48h后活杀一批荷瘤兔检测其TK mRNA及蛋白表达情况,监测荷瘤兔肿瘤大小及荷瘤兔生存时间,治疗结束后使用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况,HE染色检测肿瘤生物学形态。结果:HIFU+HSV-TK+US+MB组与HSV-TK+US+MB组中TK mRNA表达及GFP蛋白的表达无统计学意义,而与其他各组比较均高于其他各组,且有统计学意义(P0.05)。HIFU+HSV-TK+US+MB组抑瘤效应明显高于其他各组(P0.05),且能明显改善荷廇兔的生存时间;TUNEL染色HIFU+HSV-TK+US+MB组肿瘤细胞凋亡指数明显比其他各组高(P0.05);结论:HIFU联合载HSV1-TK自杀基因超声微泡治疗VX2兔肝癌能明显抑制其肿瘤细胞的生长,明显改善荷瘤兔的生存时间,为HIFU联合基因治疗肝癌提供了较为可靠的实验依据。


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