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环磷酰胺损害未成熟睾丸血睾屏障的机制及防护研究

刘丰  
【摘要】:背景: 由于化疗药物环磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)的广泛使用,其毒副作用也逐渐引起了临床的关注,其中环磷酰胺对儿童生育功能的远期影响及如何防护已成为儿童肿瘤学研究的热点之一。环磷酰胺在体外没有活性,只有在体内经过代谢后才具有抗肿瘤等生物活性。而丙烯醛(Acrolein,ACR)是环磷酰胺的主要代谢副产物,是环磷酰胺的主要毒性因子。多年来,国内外一些学者研究烷化剂对睾丸生殖毒性的损伤主要局限在组织形态学的观察,本课题组在前期研究中发现环磷酰胺可导致生精上皮变薄,Sertoli细胞分布稀疏,细胞间隙扩大,提示血睾屏障(BTB)受损,但其机制尚不清楚,环磷酰胺通过何种途径损破坏血睾屏障仍是当今研究的热点与难点。 目的: 向未成熟SD大鼠腹腔注射CP,探讨CP对睾丸支持细胞骨架及紧密连接的影响,在此基础上分离大鼠睾丸Sertoli细胞进行原代培养,进一步研究CP的主要代谢产物ACR损伤血睾屏障的机理及银杏黄酮预处理对支持细胞的保护作用,为进一步临床应用奠定理论基础。 方法: ①未成熟SD大鼠腹腔注射CP,电镜技术观察睾丸支持细胞间紧密连接的改变,S-P免疫组化法及免疫印迹法检测细胞间紧密连接蛋白Occludin及ZO-1的表达、免疫荧光检测细胞骨架F-actin的表达情况,初步探讨体内CP损伤血睾屏障的机理; ②分离未成熟SD大鼠睾丸Sertoli细胞并进行原代培养,ACR处理细胞后,MTT法检测Sertoli细胞的活力;分光光度法测定Sertoli细胞主要抗氧化酶的改变;超氧化物阴离子荧光探针染色观察细胞内超氧化阴离子的情况;透射电镜观察Sertoli细胞超微结构的变化;免疫荧光检测Sertoli细胞骨架中F-actin的改变;流式细胞仪检测细胞凋亡情况并用免疫印迹法检测丙烯醛处理Sertoli细胞后细胞内磷酸化p38MApK活性的变化,探讨ACR损伤Sertoli细胞的可能机理; ③在ACR损伤Sertoli细胞的基础上,加用银杏叶标准提取物银杏黄酮作为干预因素,利用免疫荧光染色观察细胞骨架F-actin的改变;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;免疫印迹法检测细胞内磷酸化p38MApK活性的变化,探讨银杏黄酮体外对Sertoli细胞ACR所致损伤的保护作用; 结果: 1.环磷酰胺腹腔注射后对大鼠睾丸紧密连接损伤的相关检测结果 ①电镜检测:对照组可见支持细胞连接处光滑清楚,走行自然;而处理组连接处细胞膜分离,其间出现较大间隙,连接旁内质网也出现程度不等的扩张。 ②S-P免疫组化检测:结果发现细胞间紧密连接蛋白Occludin及ZO-1的表达与对照组比较差异未见明显异常(P0.05)。 ③免疫荧光检测:结果发现细胞骨架蛋白F-actin的表达较对照组明显下降(P0.05)。 ④免疫印迹检测:结果发现F-actin的表达较对照组明显下降,而细胞间紧密连接蛋白Occludin及ZO-1的表达与对照组比较差异未见明显异常(P0.05)。 2. ACR在体外对支持细胞损伤的相关检测结果 ①S ertoli细胞分离培养成功,见细胞贴壁生长,长梭形,2-3个突起。检测结果Sertoli细胞纯度达90%。 ②100μM的ACR处理Sertoli细胞后,在3h及12h的细胞活力分别为(68.39±2.1)%、(52.10±1.0)%。以上数据比较,差异具有显著性(P<0.01)。 ③ACR处理后,Sertoli细胞的总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活力、总谷胱甘肽活力、过氧化氢酶活力(CAT)均较正常对照组显著降低,差异有显著性(p0.05)。 ④当用ACR处理后,ACR能增强sertoli细胞内活性氧的水平,细胞内的红色荧光明显增多,并随着时间的延长增多越明显。 ⑤免疫荧光检测结果,发现正常的细胞骨架中F-actin分布均匀,而在100μM的ACR处理细胞12h后,微丝发生聚集、边缘化和区域化。 ⑥电镜检测结果:100μM的ACR处理细胞后,与对照相比,发现线粒体肿胀,染色质凝集,胞浆浓缩和核溢裂,且空泡化特别明显,并随时间的延长变化越明显。 ⑦流式细胞仪检测细胞凋亡结果:ACR作用后,细胞凋亡率在对照组与处理组间比较,差异具有显著性意义(P0.05)。而且凋亡率随时间延长而增加,处理3小时组与12小时组之间比较也有显著性意义(P0.05)。 ⑧免疫印迹法检测:通过Western Blot检测磷酸化P38MAPK活性的结果显示,P38MAPK表达量随ACR作用时间而上升(P0.05)。 3.银杏黄酮在体外对ACR致Sertoli细胞损伤的保护作用 ①银杏黄酮预处理后,流式细胞仪检测到细胞凋亡率明显下调,与单用ACR处理组比较差异具有显著性(P0.05)。 ②银杏黄酮预处理后,支持细胞骨架F-actin的损伤明显减轻,基本接近正常F-actin的分布特征。 ③银杏黄酮预处理后,磷酸化P38MAPK的表达明显下调,与对照组比较差异有显著性(P0.05)。 结论: ①环磷酰胺对血睾屏障的紧密连接有明确的影响,其可导致连接处细胞膜分离,其间出现较大间隙,连接旁内质网也出现程度不等的扩张,导致紧密连接瓦解,血睾屏障被破坏。 ②环磷酰胺及其代谢产物丙烯醛可能通过干扰支持细胞骨架并诱导细胞凋亡来破坏血睾屏障的稳定性。 ③环磷酰胺对紧密连接蛋白的表达没有直接影响。 ④银杏黄酮预处理能减轻支持细胞因ACR所致的细胞骨架损伤及 凋亡,其可能通过降低ACR刺激后支持细胞内ROS的水平和抑制MAPKs的激活而产生保护作用。


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