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铜绿假单胞菌重组Bb-oprE疫苗构建及其免疫机制的初步研究

朱佑明  
【摘要】:目的 构建并鉴定铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗;分析和检测重组质粒的表达效率和重组蛋白OprF的免疫原性;采用4种不同接种途径疫苗免疫小鼠后,用PAO1菌株攻击,计数实验动物(BALB/c小鼠)肺组织Pa菌荷量,观察血清IgG及其亚类、IgA和IgE的变化;通过检测小鼠脾细胞增殖情况、CD4~+和CD8~+T亚群数量、脾细胞培养上清液中CK (IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10)的变化和脾细胞凋亡情况,从而初步阐明rBb-OprF疫苗的保护性免疫机制,为Pa疫苗的研制提供有价值的理论资料。 方法 1、疫苗构建 以铜绿假单胞菌标准株PAO1的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得OprF抗原编码基因序列,用PCR扩增oprF27-1032目的基因片段,定向克隆入pGEX-1LambdaT穿梭质粒中GST标签下游的MCS,构建重组表达质粒pGEX-OprF;将重组质粒pGEX-OprF转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;用PCR鉴定和测序分析序列正确后用电穿孔法将重组质粒pGEX-OprF导入Bb,构建铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗,在mRNA水平检测其表达情况。用SDS-PAGE对pGEX-oprF在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导1~13h表达的目的蛋白进行分析,并用Western blot对重组OprF蛋白进行免疫原性鉴定。 2、保护性免疫机制 为了研究铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗对BALB/c小鼠急性Pa肺炎的保护作用,设计将56只雌性、清洁级的BALB/c小鼠按不同免疫途径随机分为7组,每组8只。 A组: rBb-OprF疫苗皮下注射(SC),将5×10~6CFU疫苗悬浮于100μL的MRS液体培养基,背部皮下注射1次; B组:rBb-OprF肌肉注射(IM),将5×10~6CFU的疫苗悬浮于100μL的MRS液体培养基,对小鼠后腿股四头肌注射1次; C组:rBb-OprF鼻腔粘膜接种(IN),将5×10~5CFU的疫苗悬浮于100μL的MRS液体培养基,鼻腔黏膜接种1次; D组:rBb-OprF口服灌胃接种(PO),将5×10~8CFU的疫苗悬浮于100μL的MRS液体培养基,口服灌胃1次; E组:空载体对照组(Ca),将5×10~6CFU的Bb(pGEX-1LambdaT)悬浮于100μL的MRS液体培养基,背部皮下注射1次; F组:Bb对照组(Bb),将5×10~6CFU的Bb悬浮于100μL的MRS液体培养基,背部皮下注射1次; G组:MRS对照组(MRS),100μL的MRS液体培养基,背部皮下注射1次。 各组按上述接种BALB/c小鼠后8w,乙醚麻醉,用弯曲接种针吸50μL的109CFU/mL的浮游PAO1菌株,从鼻腔注入。在PAO1株鼻腔感染攻击后1w,收集血清和脾细胞,用经典的ELISA法检测各组小鼠血清特异性的IgG及其亚类、IgA和IgE抗体水平;用MTT比色法检测脾细胞原液或PaAg刺激后细胞增殖水平变化;利用FCM检测脾细胞CD++4和CD8亚群变化;用ELISA法检测脾细胞原液或PaAg刺激后培养上清液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10的水平以及用AnnexinV-FITC试剂盒检测脾细胞凋亡率。 结果 采用RT-PCR扩增出1016bp的OprF编码基因;成功构建pGEX-OprF重组质粒,经双酶切鉴定,切出4947bp的载体片段和1016bp的目的基因片段;序列分析发现其与预期结果一致;以rBb抽提质粒为模板进行PCR扩增可得到1016bp的oprF基因片段,以阳性rBb的总RNA为模板进行RT-PCR扩增,产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见一条约1016bp的条带,证明外源基因oprF能够在Bb中表达mRNA。SDS-PAGE分析表达产物分子质量约为61kDa,与预期结果一致,表达的目的蛋白质占菌体总蛋白的16%;Western blot鉴定结果重组蛋白能被Pa外膜粗抗原免疫小鼠血清识别,提示重组OprF抗原与天然OprF蛋白具有相同的抗原性,成功构建铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗。 rBb-OprF疫苗免疫后8w,用50μL的10~9CFU/ml的浮游PAO1菌株鼻腔内感染攻击后1w检测: (1)疫苗组肺Pa荷菌量:SC组、IM组、IN组和PO组肺组织Pa菌荷量均低于MRS对照组,SC组与IM组、IN组和PO组间存在差异;空载体、Bb和MRS对照组间差异无统计学意义。 (2)ELISA法检测血清抗体结果:疫苗免疫组血清IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b水平显著增加;皮下注射组和口服灌胃组IgG3水平显著增加;皮下注射组IgA水平增加;疫苗免疫组IgE水平无明显变化。 (3)MTT法检测的小鼠脾淋巴细胞增殖结果:所有疫苗接种组脾T细胞增殖明显,SC组和IM组高于IN组和PO组。 (4)流式细胞仪检测脾CD4+T细胞和CD8+T细胞结果:各疫苗组脾细胞CD+4T细胞和CD+8T细胞显著增加;CD4+T细胞在SC组最高,CD+8T细胞在SC组、IM组和IN高于PO组。 (5)应用Annexin V-FITC kits检测小鼠脾细胞凋亡结果:疫苗接种组脾细胞凋亡发生率降低,SC组低于IM组、IN和PO组。 结论 通过RT-PCR成功扩增出OprF抗原编码基因;成功构建铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗;重组质粒pGEX-OprF能在大肠杆菌BL21中表达,表达效率较高,重组融合蛋白具有与天然OprF蛋白相同的抗原性;rBb-OprF疫苗能诱导BALB/c小鼠产生较强的保护性免疫反应,皮下和肌肉注射接种是较好的接种途径;铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗可诱导小鼠产生混合型的Th1和Th2免疫应答。


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