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大鼠蛛网膜下腔出血后脑微血管的比较蛋白质组分析

谢宗义  
【摘要】:目的 建立激光捕获显微切割(laser capture microdissection, LCM)技术分离脑微血管和微血管蛋白质组双向凝胶电泳(two-dimensional gelelectrophoresis,2-DE)的技术平台,运用比较蛋白质组学分析鉴定蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)后不同时间点脑微血管的差异表达蛋白质,为在蛋白质水平进一步阐明SAH后微血管损伤的分子机制奠定基础。 方法 1建立SAH模型:采用视交叉前池注血法建立大鼠SAH模型。 2分析SAH后脑微血管的动态改变:应用荧光分光光度计和荧光显微镜方法分别检测SAH后不同时间点血脑屏障(blood–brain barrier,BBB)通透性的动态改变,同时利用透射电镜观察其超微结构变化,并确定微血管改变的时相。 3LCM分离SAH后皮质微血管:采用免疫组织化学染色(CD31单克隆抗体)标记微血管内皮细胞,使用LCM分离皮质微血管。 4运用比较蛋白质组学分析SAH后不同时间点脑微血管的差异表达蛋白谱:通过优化2-DE的各种条件和参数,确定最佳的样品上样量、等电聚焦(isoclectfic focusing, IEF)、染色方法等。在此基础上,对SAH后不同时间点脑微血管蛋白质组进行2-DE分离。使用PDQuest软件对2-DE图像进行分析,筛选出不同时间点脑微血管的差异表达蛋白点。候选差异表达蛋白斑点经胶内酶解、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,得到肽指纹图谱(peptide mass fingerprint,PMF),使用Mascot软件在Swiss-Prot或NCBInr数据库中检索鉴定差异表达蛋白质,并对差异蛋白质进行生物信息学分析。 5验证候选差异表达蛋白:使用Western blotting验证感兴趣的蛋白质。 结果 1.SAH后6h时,可见血液广泛分布在前颅窝底、Willis环、基底池周围以及大脑半球和小脑。 2.SAH引起大脑皮质BBB通透性增加。BBB通透性开始增加出现在SAH后24h,于36h达最高峰,然后在48h开始逐渐减少,至72h恢复正常。透射电镜观察,在SAH后36h,毛细血管周围水肿明显,管腔受压;星形胶质细胞足突肿胀,线粒体轻度肿胀,但其细胞膜尚保存;内皮细胞管腔面不光滑,表面微绒毛增多,但紧密连接未见开放;基膜连续且完整。 3.优化PEN切片的固定、染色、脱水等制备方法和LCM切割参数。应用LCM技术分离SAH6h组、SAH36h组皮质微血管,分别得到32000、32500条微血管。 4.通过优化2-DE条件,最终确定合适的样品上样量为120μg、非线性pH3-l0IPG胶条、最佳染色方法为银染。通过对SAH后6h、36h脑微血管蛋白质组的2-DE图像进行对比分析,发现有81个蛋白质斑点表达有差异,其中有48个蛋白点表达明显上调,有33个蛋白点表达明显下调。对其中30个差异蛋白点进行MALDI-TOF-MS和生物信息学分析后,鉴定出了24种可能的差异表达蛋白。 5.Western blotting法对VDAC1、MAPK10两个感兴趣的蛋白质进行了鉴定,结果与2-DE分析的结果一致:与SAH6h组相比,SAH36h组脑微血管中VDAC1、MAPK10蛋白含量均明显增加。 结论 1视交叉前池注血模型更好地模拟临床SAH,重复性好,适合于前循环动脉瘤性SAH后病理生理学机制的研究。 2SAH引起BBB结构和功能最显著的变化出现在36h,而且,这些病理改变对SAH后继发性脑损伤和不良预后有着重要的影响。 3LCM技术是一种强有力的分离方法,能从脑组织中分离出纯度较高的微血管,可用于基因组学和蛋白质组学研究。 4鉴定出的24种差异表达蛋白可能在SAH后脑微血管损伤过程中起重要作用。


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