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REGγ基因沉默对甲状腺癌生长、周期及凋亡的影响

张矛  
【摘要】:第一部分REG、p21、p27和PCNA在人甲状腺癌组织中的表达及意义 目的探讨REG、p21、p27和PCNA在人甲状腺癌及正常组织的表达及意义 方法采用免疫组化、Western blot及斑点印迹法等分子生物学方法测定REG、p21、p27和PCNA在人甲状腺癌组织和正常甲状腺组织的表达。 结果①REG表达:甲状腺癌组织REG表达明显高于正常甲状腺组织;低分化甲状腺癌组织REG的表达明显高于高分化甲状腺癌组织,高分化甲状腺癌中,有淋巴结转移癌组织的REG表达明显高于无淋巴结转移的癌组织。②p21表达:甲状腺癌组织p21表达明显低于正常甲状腺组织;低分化甲状腺癌组织p21表达明显低于高分化甲状腺癌组织,高分化甲状腺癌中,有淋巴结转移癌组织的p21表达明显低于无淋巴结转移的癌组织。③p27表达:甲状腺癌组织p27表达明显低于正常甲状腺组织;低分化甲状腺癌组织p27表达明显低于高分化甲状腺癌组织,高分化甲状腺癌中,有淋巴结转移癌组织的p27表达明显低于无淋巴结转移的癌组织。④PCNA表达:甲状腺癌组织PCNA表达明显高于正常甲状腺组织;低分化甲状腺癌组织PCNA的表达明显高于高分化甲状腺癌组织,高分化甲状腺癌中,有淋巴结转移癌组织的PCNA表达明显高于无淋巴结转移的癌组织。 结论甲状腺癌组织中REG和PCNA异常高表达与肿瘤的发生,淋巴结转移及恶性程度密切相关;甲状腺癌组织中p21和p27异常低表达与肿瘤的发生,淋巴结转移及恶性程度密切相关。 第二部分REGγ蛋白shRNA表达载体的构建及鉴定 目的在人甲状腺癌细胞中构建及鉴定REG蛋白shRNA表达载体。 方法按照Elbashir等及Reynolds的设计原则设计并合成针对REG蛋白编码基因REG的shRNA,并克隆入转录载体pGenesil-1,构建重组质粒pshRNA1-REG,pshRNA2-REG和pshRNA-HK(阴性对照质粒);中量提取重组质粒,采用LipofectamineTM2000转染人甲状腺髓样癌细胞TT和甲状腺未分化癌SW579细胞,G418筛选后,应用RT-PCR、Western Blot及斑点印迹法分别在mRNA和蛋白水平检测REG基因的干扰效果。 结果成功构建三个重组质粒,分别为pshRNA1-REG、pshRNA2-REG和通用阴性对照质粒pshRNA-HK;应用LipofectamineTM2000将上述重组质粒成功转染至人甲状腺癌细胞内,转染效率高达80%以上。pshRNA2-REG的转染效果略好于pshRNA1-REG。检测结果显示pshRNA2-REG转染的甲状腺癌细胞REG蛋白及mRNA的表达明显低于pshRNA-HK转染的甲状腺癌细胞。 结论重组质粒pshRNA-REG转染能显著地抑制人甲状腺癌细胞REG的表达。 第三部分RNA干扰沉默REGγ基因表达对p21、p27及PCNA表达的影响 目的以RNA干扰技术沉默REGγ基因表达,探讨人甲状腺癌细胞内REGγ表达下降对p21、p27及PCNA表达的影响 方法将重组质粒pshRNA-HK及pshRNA-REG转染至人甲状腺癌细胞内,G418筛选,应用Western blot、斑点印迹和RT-PCR等方法测定RNA干扰前后p21、p27及PCNA在甲状腺癌细胞中的表达情况。 结果①p21的表达:pshRNA-REG转染的甲状腺癌细胞内的p21蛋白表达明显高于pshRNA-HK转染的及未转染的甲状腺癌细胞,而p21mRNA的表达无明显差别。②p27的表达:pshRNA-REG转染的甲状腺癌细胞内的p27蛋白及mRNA表达与pshRNA-HK转染的甲状腺癌细胞无明显差别。③PCNA的表达:pshRNA-REG转染的甲状腺癌细胞内的PCNA蛋白及mRNA表达明显低于pshRNA-HK转染的及未转染的甲状腺癌细胞。 结论RNA干扰沉默REGγ基因表达可使甲状腺癌细胞的p21蛋白表达增加以及PCNA蛋白和mRNA表达降低。 第四部分RNA干扰沉默REGγ基因表达对甲状腺癌细胞增殖及细胞 周期的影响 目的以RNA干扰技术沉默REGγ基因表达,探讨REGγ表达下降对人甲状腺癌细胞增殖及细胞周期的影响。 方法将重组质粒pshRNA-HK及pshRNA-REG转染至人甲状腺癌细胞内,G418筛选,应用四唑盐(MTT)比色法和流式细胞仪来检测RNA干扰前后人甲状腺癌细胞增殖及细胞周期的变化。 结果pshRNA-REG转染的甲状腺癌细胞的生长速度明显慢于pshRNA-HK转染的及未转染的甲状腺癌细胞;pshRNA-REG转染的甲状腺癌细胞的生长周期阻滞在G1-S期,G1期细胞比例明显大于pshRNA-HK转染的及未转染的甲状腺癌细胞。 结论RNA干扰沉默REGγ基因表达可抑制甲状腺癌细胞的增殖以及使甲状腺癌细胞周期阻滞。 第五部分RNA干扰沉默REGγ基因表达对甲状腺癌细胞凋亡 的影响 目的以RNA干扰技术沉默REGγ基因表达,探讨REGγ表达下降对人甲状腺癌细胞凋亡的影响。 方法应用原位缺口标记法(TUNEL)和caspases-3蛋白WesternBlot测定法检测RNA干扰前后甲状腺癌细胞凋亡的变化情况。 结果①pshRNA-REG转染的甲状腺癌细胞的凋亡指数明显高于pshRNA-HK转染的及未转染的甲状腺癌细胞。②pshRNA-REG转染的甲状腺癌细胞的caspases-3蛋白含量明显高于pshRNA-HK转染的及未转染的甲状腺癌细胞。 结论RNA干扰沉默REGγ基因表达可促进甲状腺癌细胞的凋亡。REGγ,甲状腺癌,凋亡


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