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视黄酸核受体β介导的ATRA对骨髓间充质干细胞成神经分化促进作用的实验研究

龚敏  
【摘要】:第一部分全反式视黄酸对骨髓间充质干细胞成神经分化的影响观察及诱导条件优化 目的探讨不同浓度ATRA预诱导对rMSCs神经分化效率、细胞形态、分化成熟度、细胞增殖和凋亡、细胞功能方面的影响作用,以筛选ATRA最佳诱导浓度;并检测最佳浓度ATRA预诱导对诱导后神经元样细胞神经相关标志物表达和神经细胞功能的影响;同时观察RA信号通路中关键受体RARs在ATRA预诱导促进rMSCs神经分化过程中的变化。 方法采用全骨髓培养法分离培养rMSCs,并用流式细胞术鉴定rMSCs。采用0、0.01、0.1、1、10、100μM几个不同浓度对rMSCs进行预诱导,后续采用MNM神经诱导液进行神经分化诱导;计算rMSCs神经分化率,Nikon Elements D软件测量分化后神经元样细胞胞体直径和轴突长度;胎盘蓝染色计算细胞死亡率、MTS检测神经元样细胞生长存活情况、Hoechst荧光染料观察神经元样细胞凋亡;Real-time PCR检测不同浓度ATRA预诱导时神经元标志物Nestin、NSE、MAP-2的表达情况。确定最佳ATRA预诱导浓度后,采用RT-PCR和免疫荧光检测不同处理组细胞神经元标志物Nestin、NSE、MAP-2和胶质细胞标志物GFAP、CD68、GDNF的表达情况;并用western blotting检测ATRA预诱导rMSCs神经分化不同时间点Nestin和NSE蛋白表达的变化趋势;然后采用膜片钳和钙离子检测系统检测不同处理rMSCs分化后神经元样细胞功能情况。最后,采用real-time PCR和免疫荧光检测不同处理诱导后细胞RA信号转导通路RARs表达情况。 结果(1)rMSCs的分离培养、扩增和流式细胞鉴定:rMSCs呈梭形,漩涡状生长;流式细胞术鉴定发现99%以上的rMSCs表达CD29、CD44、CD106和CD90,几乎不表达CD45和CD34。(2)不同浓度ATRA预诱导对rMSCs神经分化的作用:经MNM诱导后,rMSCs分化为双极或多极神经元细胞形态;ATRA浓度在0.01-10μM范围内,ATRA浓度越高,神经样细胞分化效率越高,神经元胞体直径越大,轴突更长(p0.05);1μM浓度ATRA时,分化后细胞死亡率和凋亡率最低(p0.01/p0.05);0.01-1μMATRA预诱导对细胞的生长增殖没有作用,而10μM以上的ATRA预诱导明显抑制细胞增殖;Real-time PCR结果显示1μM ATRA预诱导神经分化细胞神经相关标志物Nestin、NSE、MAP-2的表达最高;1μM浓度ATRA预诱导为最佳浓度。(3)ATRA预诱导提高rMSCs在MNM神经诱导环境下向神经元分化:RT-PCR结果发现,ATRA单独预诱导不引起成熟神经元表面标志的表达,仅神经干细胞Nestin的表达稍有增加;预诱导的rMSCs神经分化后Nestin、NSE及MAP-2神经元相关标志物表达更高,而GFAP、CD68胶质细胞标志物表达较未预诱导为低;免疫荧光也显示,预诱导的rMSCs神经分化后Nestin、NSE及MAP-2神经元相关标志物表达更高,而胶质细胞相关标志物GDNF表达更低。ATRA预诱导+MNM神经诱导0-36小时,NSE的表达逐渐增高,而Nestin表达先增高,随后下降,于MNM诱导后18小时达顶峰。(4)ATRA预诱导rMSCs神经分化所得神经元样细胞在功能上具有更大优势:静息膜电位显示,经ATRA预诱导后所得神经元样细胞较单独经MNM诱导的神经元样细胞有更大负值膜电位(p0.05);钙影像显示,经ATRA预诱导的神经元样细胞则较单独MNM诱导分化细胞钙振荡效应更强(p0.05)。(5)ATRA,MNM诱导rMSCs神经分化过程中RARs的表达变化:RARα、RARγ在rMSCs中有较高的表达,但RARβ几乎不表达;rMSCs经MNM诱导神经分化后RARα、RARβ、RARγ不同程度被激活,其中以RARβ最为明显;而仅经ATRA预诱导后rMSCs只有RARβ表达上调;ATRA预诱导rMSCs神经分化后RARβ上调比未经ATRA预诱导rMSCs神经分化后更高;另外,rMSCs神经分化后RARβ还出现定位表达变化,向胞核周边聚集。 结论(1)通过全骨髓培养我们成功获取了rMSCs细胞,并经流式细胞术鉴定。(2)rMSCs可以有效地被诱导为神经元样细胞,而且不仅是形态上和神经标志物上,还具有一定的神经细胞功能基础。(3)ATRA预诱导能够促进rMSCs神经分化,能够提高分化后神经元样细胞的存活率并抑制其凋亡发生,最佳的预诱导浓度为1μmol/L。(4)ATRA预诱导促进rMSCs向神经元方向分化,抑制向神经胶质细胞方向分化;所得神经元样细胞在功能上具有更大优势。(5)rMSCs神经分化过程中RA信号被激活,RARβ尤为明显;RARβ还出现定位表达变化,ATRA预诱导促进rMSCs神经分化可能与预先激活RARβ信号有关。 第二部分携带大鼠视黄酸核受体RARα、RARβ、RARγ基因的重组腺病毒及视黄酸核受体RARβ的siRNA重组腺病毒构建及功能鉴定 第一章携带RARα、RARβ、RARγ基因的重组腺病毒构建及功能鉴定 目的构建携带大鼠视黄酸核受体α、β、γ(retinoic acid receptor α、β、γ,RARα、β、γ)的重组腺病毒,为研究RARα、β、γ在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成神经分化中的作用奠定基础。 方法体外扩增大鼠RARα、RARβ、RARγ基因,将其定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TOX构建重组质粒pAdTrace-RARα、pAdTrace-RARβ、 pAdTrace-RARγ,并在BJ5183菌中与骨架质粒pAdEasy-1重组获得腺病毒载体pAd-RARα、pAd-RARβ、pAd-RARγ,Pac I酶切后转染HEK293细胞包装腺病毒。腺病毒Ad-RARα、Ad-RARβ、Ad-RARγ感染大鼠MSCs,real time PCR和western blotting检测RARα、RARβ、RARγ的表达。 结果PCR,酶切及测序均证实RARα、RARβ、RARγ正确克隆至腺病毒质粒载体中,Ad-RARα、Ad-RARβ、Ad-RARγ对rMSCs感染率达60-70%,并明显增强RARα、RARβ、RARγ基因和蛋白的表达。 结论成功构建携带RARα、RARβ、RARγ的重组腺病毒,并具有上调rMSCs中RARα、RARβ、RARγ目的基因和蛋白表达的功能。 第二章视黄酸核受体RARβ的siRNA重组腺病毒构建及功能鉴定 目的构建视黄酸核受体RARβ的siRNA重组腺病毒,为反向研究RARβ受体在ATRA预诱导促进rMSCs成神经分化中的确切作用。 方法设计4对大鼠RARβ的siRNA序列,将其分别克隆到pSES-HUS穿梭质粒;进而将重组穿梭质粒pSES-HUS-siRARβ与pAdEasy-1在BJ5183感受态大肠埃希菌内同源重组以得到pAd-siRARβ,Pac I酶切线性化后转染HEK293进行包装扩增以得到重组腺病毒Ad-siRARβ;Ad-siRARβ感染rMSCs细胞48h,提取各组mRNA和总蛋白,real time PCR和western blotting检测Ad-siRARβ-1、-2、-3、-4对RARβ的抑制效率。 结果PCR,酶切及测序均证实RARβ的siRNA序列正确克隆至腺病毒质粒载体,经过包装扩增得到大量高滴度重组腺病毒Ad-siRARβ,其中Ad-siRARβ-1、-2、-3可明显抑制RARβ表达,Ad-siRARβ-4没有明显效果,Ad-siRARβ-pool效果最佳。 结论成功构建视黄酸核受体RARβ的siRNA重组腺病毒,而且对RARβ基因和蛋白的表达能够起特异性下调作用。 第三部分视黄酸核受体在骨髓间充质干细胞成神经分化的作用探讨 目的采用Ad-RARα、Ad-RARβ、Ad-RARγ分别过表达具体某一种RAR亚型来研究每种RAR核受体信号对rMSCs神经分化的影响;采用Ad-siRARβ及RARβ特异性拮抗剂下调或阻断RARβ信号来反向研究RARβ信号在ATRA预诱导对rMSCs神经分化中的作用。 方法设定Ad-RFP、 Ad-RFP+MNM、 Ad-RFP+RA+MNM、Ad-RARα+MNM、Ad-RARβ+MNM、Ad-RARγ+MNM共计六组,加入一定量Ad-RARα、Ad-RARβ、Ad-RARγ于完全培养基中,病毒对照组加入Ad-RFP,Ad-RFP+RA组同时加入Ad-RFP和RA进行预处理,24小时后弃培养基并用D-Hank's漂洗两次,加入MNM成神经诱导液诱导24小时后,进行后续实验;设定Ad-RFP+MNM、Ad-RFP+RA+MNM、Ad-siRARβ+RA+MNM、 LE135+RA+MNM共计四组,加入一定量Ad-RFP、Ad-siRARβ处理24小时后,再加入RA,LE135+RA+MNM组则同时加入LE135+RA处理24小时后,弃培养基并用D-Hank's漂洗两次,加入MNM成神经诱导液诱导24小时后,进行后续实验。后续采用real time PCR、western blotting和免疫荧光检测神经分化后细胞神经元相关标志物的表达情况;然后采用膜片钳和钙离子检测系统检测不同处理rMSCs分化后神经元样细胞功能情况。 结果(1)RARα和RARγ过表达时Nestin、NSE、MAP-2、Tau和β-III-tubulin等神经元相关标志物表达与Ad-RFP空载感染rMSCs组大概一致,而RARβ过表达时以上神经元相关标志物表达则高于Ad-RFP空载对照组,且与ATRA预诱导组相当;另外,RARα和RARγ过表达时诱导分化的神经元样细胞静息膜电位和钙离子震荡效应与Ad-RFP空载感染rMSCs组大概一致,而RARβ过表达时诱导分化的神经元样细胞静息膜电位和钙离子震荡效应明显强于Ad-RFP空载感染组且基本与ATRA预诱导组相似。(2)Ad-siRARβ沉默或LE135特异性阻断ATRA预诱导对RARβ激活作用后,rMSCs神经分化后Nestin、NSE、MAP-2、Tau和β-III-tubulin等神经元相关标志物表达较阻断前ATRA预诱导组明显降低;而且rMSCs成神经分化后细胞静息膜电位和钙离子震荡效应也较ATRA预诱导组明显降低。 结论(1)预先激活RARα和RARγ信号对于rMSCs神经分化影响不大,没有明显的促进作用。(2)预先激活RARβ信号促进rMSCs神经分化和功能成熟,而且促进作用与ATRA相当;阻断RARβ信号可抑制ATRA促进MNM诱导rMSCs成神经分化作用。(3)ATRA对rMSCs神经分化的促进作用可能主要是通过RARβ信号介导而实现的。


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