结核性脑膜炎患者脑脊液单核细胞内结核抗原检测的应用研究

【摘要】：目的：结核性脑膜炎（Tuberculous meningitis, TBM）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的中枢神经系统感染性疾病，约占结核病的7～10%，是以脑膜、大脑实质受损为主，并可波及脊髓、脊膜的非化脓性炎症。TBM临床症状复杂、不典型，早期影像学检查无特异性改变，而赖以诊断颅内感染的脑脊液生化、细胞学检查结果往往与其它类型颅内感染有所重叠，并不能简单借以鉴别感染类型。MTB是胞内寄生菌，机体受到MTB感染后，其首先被单核巨噬细胞吞噬，故使用免疫学方法检测脑脊液单核细胞内的结核杆菌特异性抗原或许可作为TBM诊断的较为简捷、敏感、并且特异性高的诊断方法。ESAT-6即6kDa早期分泌性抗原靶，是从MTB短期培养滤液中分离纯化出的一种低分子量分泌性蛋白，在早期感染的单核细胞内生长时，ESAT-6蛋白表达即明显提高，因此推测检测单核细胞内ESAT-6具有更好的敏感性。本实验第一部分选择结核分枝杆菌早期分泌抗原ESAT-6与PPD为检测对象，采用免疫荧光细胞化学染色的方法观察单核细胞的染色情况，判断结核抗原的存在，而第二部分在以上基础上通过激光扫描共聚焦显微镜技术(Laser scanning confocalmicroscope,LSCM)对部分TBM及对照组患者外周血及脑脊液单核细胞内的ESAT-6进行检测，同时对细胞做分层扫描，进行三维重建和ESAT-6相对荧光强度值测定而达到对细胞内结核抗原的定性、定量、定位及动态变化分析，进一步探寻TBM的发病机制。 方法：所有病例均来自宁夏医科大学附属医院神经内科、宁夏结核病医院2009年12月～2012年2月临床诊断为结核性脑膜炎的住院患者，共60例。其中男性32例，女性28例；发病年龄16岁～76岁，中位值年龄28.5岁；选用Thwaites等提出的TBM临床诊断标准作为纳入标准。对所有患者均进行脑脊液常规、生化、细胞学检查（MGG染色）和阿利新兰染色。免疫荧光细胞化学法标记外周血及脑脊液单核细胞内的PPD、ESAT-6抗原。采用荧光显微镜进行观察，部分涂片经LSCM观察并测定相对荧光强度。 结果：TBM组抗结核药物治疗前脑脊液标本MGG染色呈混合细胞学反应，淋巴细胞及激活淋巴细胞比例占主导；抗结核药物治疗15d脑脊液中性粒细胞计数略有减少，激活淋巴细胞比例明显增加；抗结核药物治疗30d脑脊液标本MGG染色呈淋巴细胞为主的混合细胞学反应，中性粒细胞老化，激活淋巴细胞仍较多，并可见激活的单核细胞。PPD、ESAT-6荧光免疫细胞化学染色检测结果示：TBM组外周血（PB）及脑脊液单核细胞中PPD的阳性检出率分别为63.3%(38/60)和83.33%(50/60)；对照组PB及脑脊液单核细胞中PPD的阳性检出率分别是6.45%（4/62）和4.84%（3/62）。 TBM组PB及脑脊液单核细胞中ESAT-6的阳性检出率分别为53.33%(32/60)和76.67%(46/60)；对照组PB及脑脊液单核细胞中ESAT-6阳性检出率均为3.23%（2/62）。PPD和ESAT-6在TBM患者中的检出率均明显高于非TBM患者。两组相比有显著统计学差异。ESAT-6较之PPD有着更好的特异性。 对20例ESAT-6阳性的TBM患者及20例ESAT-6阴性的对照组患者PB及脑脊液细胞涂片进行免疫荧光双标记后在LSCM下观察，结果见TBM组ESAT-6均匀分布于单核细胞胞浆和胞膜。阳性单核细胞体积略大，呈圆形或卵圆形。胞浆较松散，呈绿色荧光，而对照组阴性染色细胞则结合的荧光很少，普遍荧光强度极弱，所有胞核均呈蓝色。经检测，TBM组PB及脑脊液单核细胞ESAT-6平均荧光值分别为(22.45±13.35；26.55±11.34)，与对照组(2.45±0.89；2.22±0.37)相比有显著统计学差异(P0.01)。对20例TBM患者于治疗3周后再次进行如上检测，结果治疗后的ESAT-6平均荧光值明显降低，治疗前后比较有统计学差异。 结论：（1）初步建立了利用免疫荧光细胞化学法检测TBM单核细胞内抗原的方法。（2）ESAT-6在TBM脑脊液单核细胞中有较好的表达，对照组中检出率低，提示其可以作为TBM临床检测指标。（3）开展利用LSCM对脑脊液细胞中的结核抗原进行定性、定位、定量及动态检测的方法将有利于进一步了解TBM的发病机制。