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Apelin在多囊卵巢综合征中表达及对颗粒细胞作用机制的初步探讨

罗爽  
【摘要】:多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是生育期女性常见的一种内分泌紊乱伴代谢异常疾病,发病率4-10%,以稀发排卵或持续无排卵、高雄激素血症、胰岛素抵抗(IR)和卵巢多囊样改变为特征。PCOS患者近期表现为月经失调、不孕、多毛、痤疮、肥胖,远期心血管疾病、糖尿病、肿瘤发生风险明显增高,PCOS严重威胁患者的生理及心理健康。生育期PCOS女性排卵异常是月经稀发或闭经、不孕的最主要原因。研究PCOS患者卵泡发育,有利于了解其生理病理改变及其可能的发病机制。PCOS患者卵巢内的始基卵泡数量与正常健康妇女比较无明显差异,而窦状卵泡、闭锁卵泡数量明显增多,无优势卵泡发育,导致排卵障碍,影响月经、妊娠及妊娠结局等。有学者提出PCOS是原发性卵泡病,而颗粒细胞的增殖、凋亡是卵泡发育及闭锁的根本原因,研究发现卵巢局部众多细胞因子通过旁分泌或者自分泌等方式参与颗粒细胞增殖或凋亡。 无排卵PCOS患者改变生活方式后,排卵恢复者的体重、腹部脂肪减少比未恢复者更明显;此外PCOS患者内脏脂肪持续减少与排卵恢复紧密相关。可见肥胖及IR相关脂肪因子在PCOS患者卵泡发育中有重要影响,近年大量国内外研究侧重于探讨脂肪因子如脂联素、瘦素等在PCOS患者基因表达和(或)蛋白功能缺陷对脂、糖代谢影响,而对各种脂肪因子对PCOS患者卵泡发育微环境影响研究较少。 Apelin为孤独G蛋白偶联受体-血管紧张素Ⅱ受体1相关的受体蛋白APJ的天然配体,apelin广泛分布于脑、胃、心、肺、肾、乳腺、子宫和卵巢等组织,参与血管平滑肌细胞、成骨细胞、血管内皮细胞等细胞增殖与分化调节。2005年研究发现鼠、人类皮下组织的脂肪细胞可分泌apelin,作为新发现的脂肪因子,诸多研究发现apelin参与IR相关的代谢综合征疾病,如肥胖、2型糖尿病、原发性高血压、PCOS等发病。有关apelin与PCOS发病研究中,王芳发现PCOS患者apelin水平显著高于对照者,apelin水平与BMI、腰围、Ins和HOMA-IR成正相关,BMI是影响血清apelin水平的独立相关因素;而G ren发现PCOS患者血清apelin水平升高与临床特征及生化指标之间无相关性;Chang发现PCOS患者血清apelin水平与对照组比较明显降低,并与载脂蛋白A负相关,可能参与远期心血管疾病发生。目前apelin与PCOS的研究处于初期阶段,但所有的研究表明,apelin可能参与PCOS发病,其具体作用机制有待研究。本研究通过检测PCOS患者血清apelin的表达,探讨其与患者脂、糖代谢和性激素之间的相关性;研究PCOS大鼠卵巢apelin/APJ表达情况和apelin对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞影响,以进一步探索PCOS复杂的发病机制。本研究共分如下四部分: 第一部分:Apelin在多囊卵巢综合征患者血清中的表达及意义 目的检测PCOS患者血清apelin水平及与脂、糖代谢及性激素相关性。方法采用化学发光法检测50名PCOS患者及20名健康对照者空腹血糖(FBG)、胰岛素(Ins)、总胆固醇(TG)、甘油三酯(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平;采取磁酶免疫法测定卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、催乳素(RPL)、睾酮(T)的血清浓度;采用酶联免疫法测受试验者血清apelin水平。结果(1)PCOS患者WHR[0.84(0.08)]、BMI[22.88(3.15)kg/m2]、T[0.66(0.35)ng/ml)、Ins[9.07(8.27)μu/ml]、LH[9.90(5.85)mIU/ml]、HOMA-IR[1.93(1.80)]与健康对照组WHR[0.79(0.05)]、BMI[(19.88(2.95)kg/m2]、T[0.29(0.23)ng/ml]、Ins[5.98(3.02)μu/ml]、LH[3.45(2.88)mIU/ml、HOMA-IR[1.26(1.43)]比较,差异均有统计学意义(P0.05或P0.001)。(2)PCOS患者血清apelin[501.40(98.66)pg/ml]明显高于对照者[416.77(61.07)pg/ml](P0.001);PCOS肥胖者apelin[520.80(100.27)pg/ml]、PCOS非肥胖者apelin[497.28(98.69)pg/ml]分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.001);PCOS肥胖与非肥胖者apelin比较,差异有统计学意义(P0.05)。(3)PCOS患者apelin水平与HOMA-IR、BMI、WHR、Ins、FBG成正相关(r=0.43,P=0.007;r=0.38,P=0.02;r=0.456,P=0.003;r=0.977,P=0.000;r=0.335,P=0.017),与HDL(r=-0.456,P=0.005)成负相关。(4)二项logistic回归分析显示apelin与PCOS发病有关(P0.05)。结论(1)PCOS患者血清apelin水平明显高于正常对照者。(2)PCOS患者血清apelin水平与肥胖及IR密切相关,apelin可能与PCOS发病有关。 第二部份:Apelin/APJ在PCOS大鼠卵巢中的表达及意义 目的探讨apelin/APJ在PCOS大鼠卵巢组织中的表达。方法21日龄SD鼠持续肌肉注射脱氢表雄酮(DHEA)21天,建立PCOS大鼠模型,观察体重、卵巢重量、HE染色观察卵巢改变;测定E2、T、P、FSH、LH水平;采用免疫组化法观察apelin/APJ在PCOS大鼠卵巢中分布与表达;qRT-PCR检测卵巢组织内apelin/APJ mRNA表达,W-B检测卵巢组织内apelin/APJ蛋白表达。结果(1)实验组大鼠体重(134.47±5.48)g与对照组(138.27±17.20)g比较,低于对照组,差异无统计学意义(P0.05);实验组大鼠卵巢重(79.87±16.34)g与对照组(91.13±21.95)g比较,低于对照组,差异无统计学意义(P0.05);实验组大鼠卵巢/体重(0.67±0.17)与对照组(0.57±0.06)比较,差异有统计学意义(P0.05)。(2)实验组大鼠血清LH(2.80±1.67)mIU/ml、T (3.28±2.00)ng/ml,与对照组LH (0.55±0.24) mIU/ml、 T(0.31±0.20)ng/ml比较,差异均有统计学意义(P0.001),实验组FSH(1.43±0.72)mIU/ml、P(2.54±0.86)pg/ml、E2(24.35±6.99)pg/ml与对照组FSH(1.03±0.33)mIU/ml、P(3.14±0.88)ng/ml、E(237.33±14.15)pg/ml比较,差异无统计学意义(P0.05)。(3)实验组卵巢组织HE染色见卵巢内有较多的早期发育小卵泡和未及时闭锁的囊状大卵泡,少见黄体,形成典型的多囊样改变卵巢,对照组卵巢内有不同阶段卵泡发育,可见黄体,无明显扩张的囊状卵泡。(4)免疫组织化学染色发现apelin/APJ分别表达于大鼠卵泡膜细胞、颗粒细胞中;实验组卵泡apelin蛋白表达的平均灰度值(623.16±14.58),对照组卵泡apelin蛋白表达平均灰度值(166.19±10.06),apelin在实验组表达量明显高于对照组(P0.05);实验组APJ蛋白表达平均灰度值为(813.56±15.75),对照组APJ蛋白表达的平均灰度值(231.21±12.08),实验组APJ表达量明显高于对照组(P0.05)。(5)实验组卵巢内apelin mRNA的相对表达量(4.61±1.93),对照组的相对表达量为(1.04±0.36),两组比较差异有统计学意义(P0.05);实验组APJ mRNA的表达量(6.81±0.94),对照组相对表达量(1.25±0.38),两组比较,差异有统计学意义(P0.05)。(5)实验组apelin蛋白相对表达量(0.52±0.13),对照组apelin蛋白相对表达量(0.31±0.04),两组比较,差异有统计学意义(P0.05);实验组APJ蛋白的相对表达(0.76±0.24),对照组表达量为(0.37±0.15),两组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论(1)DHEA可成功诱导PCOS大鼠模型。(2)apelin/APJ在大鼠卵泡内膜细胞和颗粒细胞均为阳性表达。(3)PCOS大鼠卵巢组织apelin/APJ表达明显高于对照组,可能与PCOS局部卵泡异常发育的复杂病因有关。 第三部分:Apelin对大鼠卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响 目的探讨apelin对大鼠卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响。方法原代培养SD大鼠卵巢颗粒细胞,贴壁分组后,对照组加入等容量无血清DMEM/F12培养基,低浓度组加入等容量apelin10-8mol/l,高浓度组加入等容量apelin10-6mol/l,继续培养12h、24h、48h,采用MTT法及流式细胞技术(Annexin/PI)法检测颗粒细胞增殖和凋亡率。结果(1)颗粒细胞培育12h、24h、48h后采用MTT检测,低浓度组吸光值分别为(0.30±0.03)、(0.58±0.06)、(0.64±0.02)、高浓度组分别为(0.26±0.02)、(0.50±0.11)、(0.58±0.01),两组同一时间点分别与对照组(0.13±0.02)、(0.33±0.07)、(0.35±0.02)比较,差异均有统计学意义(P0.05);48h低浓度组吸光值明显高于对照组及高浓度组(P0.001,P0.05)。(2)Annexin/PI检测细胞12h、24h、48h凋亡率,低浓度组分别为(8.15±0.43)%、(7.16±0.86)%、(6.07±0.33)%,高浓度分别为(8.45±0.89)%、(9.67±0.27)%、(12.63±0.39)%,两组同一时间点分别与空白对照组(8.85±0.57)%、(10.24±0.25)%、(15.43±0.85)%比较,差异均有统计学意义(P0.05);在48h低浓度组细胞凋亡率均明显低于对照组及高浓度(P0.001)。结论(1)高浓度和低浓度组apelin均可促进颗粒细胞增殖,48h低浓度apelin促大鼠卵巢颗粒细胞增殖作用最明显。(2)高浓度和低浓度组apelin均可抑制颗粒细胞凋亡,48h低浓度apelin抑制大鼠卵巢颗粒细胞凋亡作用最明显。 第四部分:Apelin对大鼠卵巢颗粒细胞作用信号的通路研究 目的观察apelin对大鼠卵巢颗粒细胞促增殖抑制凋亡作用的信号通路。方法(1)观察apelin10-8mol/l作用颗粒细胞0、5、15、30、60min后Akt及磷酸化Akt(pAkt)蛋白表达情况。(2)用小分子RNA干扰技术观察APJ-siRNA001、APJ-siRNA002、APJ-siRNA003在50nM、100nM浓度12h、24h、48h对颗粒细胞的转染率及对颗粒细胞APJ蛋白抑制情况;结果100nMAPJ-siRNA002转染颗粒细胞48h后可沉默APJ表达。(3)将培育的颗粒细胞分为对照组A.apelin10-8mol/l组,实验组B.apelin10-8mol/l+100nM APJ-siRNA002组,实验组C.apelin10-8mol/l+PI-3K信号抑制剂LY294002组,实验组D.apelin10-8mol/l+Akt信号抑制剂HIM0组,采用MTT观察4组细胞培育48h后增殖情况及检测Akt、p-Akt、Bad、Bax、Foxo3a、Bc1-2蛋白表达变化。结果(1)apelin10-8mol/l在5min开始激活信号Akt激酶蛋白,15min达高峰,APJ-siRNA、阻断剂LY294002和阻断剂HIM0可抑制Akt激酶磷酸化。(2)细胞培育48h后进行MTT检测A、B、C、D组细胞吸光值分别为(0.61±0.03)、(0.34±0.03)、(0.36±0.01)、(0.38±0.04),B、C、D组与对照A组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。(3)B、C、D组促进Bad、Bax、Foxo3a蛋白表达上调,与A组比较,差异有统计学意义(P0.05);B、C、D组抑制Bc1-2蛋白表达下调,与A组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论(1)apelin10-8mol/l可以激活Akt激酶;APJ-siRNA002、PI-3K信号阻断剂LY294002和Akt信号阻断剂HIM0均可抑制其激活。(2)apelin10-8mol/l促细胞增殖抗凋亡效应可被APJ-siRNA002、PI-3K信号阻断剂LY294002和Akt信号阻断剂HIM0抑制。(2)ape1in与APJ受体结合通过PI-3K/Akt信号通路参与大鼠卵巢颗粒细胞增殖与凋亡调节。


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