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应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路对成牙骨质细胞成骨效应的调控

杨珊  
【摘要】:正畸矫治力作用下,牙槽骨内压力侧的牙周膜压缩,张力侧的牙周膜拉伸,引发了牙周组织一系列分子生物学改变,最终导致压力侧骨吸收和张力侧骨形成,牙移动由此发生。牙齿在这一过程中承受相同的作用力,伴随牙周组织的改建,在牙齿移动的过程中,牙根因为受力也会发生一定程度的吸收及修复。位于牙骨质与牙周膜之间的成牙骨质细胞在牙根吸收后修复的过程中发挥着重要的作用,它的功能主要是形成牙骨质。研究成牙骨质细胞的生物学功能,探索成牙骨质细胞对牙根吸收后修复的机制是有必要的。经典Wnt/β-catenin信号通路是一条力学相关通路,现有研究已经证实力学刺激能够激活成骨细胞内经典Wnt信号转导通路,促进成骨细胞发挥成骨效应。成牙骨质细胞与成骨细胞在功能上具有极大的相识性,而力学刺激下经典Wnt信号通路对成牙骨质细胞成骨效应的调控作用,目前国内外对这方面的研究还没有,本课题主要是通过张应力刺激以及细胞信号通路的特异性阻断剂干预,以Runx2为切入点,采用实时荧光定量PCR、Western免疫印迹等方法,研究应力刺激对成牙骨质样细胞中Wnt信号通路的激活效应以及该通路对成骨因子Runx2的调控作用。对正畸力作用下成牙骨质细胞的生物学改变机制及促进牙根吸收修复的关系进行了探讨,为进一步研究正畸矫治中牙根吸收后修复的分子生物学理论提供依据。 实验分为四个部分: 1.应力刺激对成牙骨质细胞内RUNX2的调控作用 目的:探索应力刺激对成牙骨质细胞内Runx2的调控作用。方法:应用FX4000T应力加载装置对成牙骨质细胞株OCCM30分别加载张应力0h、3h、6h、12h, RT-PCR检测Runx2mRNA表达水平。结果:RT-PCR结果显示张应力刺激后,Runx2mRNA表达水平上调,且随加载时间延长呈递增趋势。结论:张应力刺激后,成牙骨质细胞内Runx2mRNA表达上调。 2.应力刺激下成牙骨质细胞内Wnt/β-catenin信号传导通路的活化水平 目的:探索应力刺激对成牙骨质细胞内经典Wnt信号通路的激活效应。方法:应用FX4000T应力加载装置对成牙骨质细胞株OCCM30分别加载张应力0h、3h、6h、12h, Western blot检测β-catenin水平。结果:Western blot结果显示张应力刺激后,β-catenin表达水平上调,且随加载时间延长呈递增趋势。结论:张应力刺激能够激活成牙骨质细胞内经典Wnt信号通路。 3.经典Wnt信号通路对成牙骨质细胞内Runx2的调控作用 目的:探索经典Wnt信号通路对成牙骨质细胞内Runx2的调控作用。方法:分别用浓度为20ng/ml,50ng/ml,80ng/ml,100ng/ml,150ng/ml的DKK1处理成牙骨质细胞株OCCM3048h, Western blot检测β-catenin水平, RT-PCR检测Runx2mRNA表达水平。结果:DKK1浓度达到80ng/ml,100ng/ml时β-catenin蛋白表达明显减少,DKK1浓度为150ng/ml时β-catenin蛋白的量显著减少,Runx2mRNA的表达量也相应减少。结论:阻断经典Wnt信号通路RUNX2mRNA的表达下调。 4.张应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路对成牙骨质细胞成骨效应的调控 目的:探索张应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路对成牙骨质细胞成骨效应的调控。方法:将实验分为A、B、C、D四组,A组为空白对照,不加力不加阻断剂;B组加力加阻断剂;C组加力不加阻断剂;D组不加力加阻断剂,加阻断剂组即B、D组加入150ng/mlDKK1,其余两组加入PBS液,48h后,加力组即B、C组放入FX4000T加载系统的孵箱,12%形变,0.5HZ,1/2正弦波条件下加载12h,A、D组放入相同孵箱中培养但不加力。结果:无张应力刺激作用时,阻断该信号通路Runx2基因的表达减少。而张应力刺激作用下,抑制Wnt/β-catenin通路活性,Runx2基因的表达也相应减少。


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