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当归多糖调控造血干细胞衰老的机制研究

张先平  
【摘要】:目的 成体干细胞是维持组织稳态的重要因素,并在机体衰老进程中起关键作用。造血干细胞(hematopoietic Stem cells,HSCs)是干细胞研究领域中开展最早、技术最成熟、认识最深入并且广泛应用于临床的一种成体干细胞。衰老机体中造血系统基本成分虽然得以维持,但HSCs的功能和数量却逐渐降低,将导致免疫功能衰退和多种老年性疾病的发生。 当归多糖(angelica sinensis polysaccharide,ASP)是从当归中分离、提取的药用有效成分,具有促进造血、抗辐射损伤、抗肿瘤和免疫调节等作用。目前,有关ASP能否延缓HSCs衰老及其作用机制尚不清楚。本研究将干细胞研究技术和祖国传统的抗衰老医学理论相结合,采用HSCs体外衰老模型的复制和X线照射致小鼠HSCs衰老等现代生物学的研究手段,分别从体外与体内两条途径系统地探讨ASP调控HSCs衰老的作用及其可能的生物学机制,旨为重新激活衰老HSCs及调控其靶向分化提供实验依据和理论基础。 方法 1.免疫磁珠分选技术(magnetic-activated cell sorting,MACS)分离、纯化干细胞抗原-1(Sca-1~+)HSCs,流式细胞术测定细胞分选纯度,台酚蓝染色检测细胞活性。 2.采用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法、细胞周期分析、甲基纤维素半固体培养等方法,观察氧化低密度脂蛋白(oxidation lowdensity lipoprotein,ox-LDL)对Sca-1~+HSCs衰老生物学特性的影响,以建立ox-LDL体外诱导Sca-1~+HSCs衰老模型。 3. ASP与ox-LDL共培养Sca-1~+HSCs,采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析及甲基纤维素半固体培养观察衰老生物学指标的变化;酶学比色法测定细胞培养上清液超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;免疫荧光检测Sca-1~+HSCs内活性氧(reactive oxygen specie,ROS)水平;荧光定量PCR及Western blot检测Sca-1~+HSCs衰老相关基因p16、p21mRNA及细胞周期调控蛋白P16、P21、CDK2、CDK4、cyclinD及cyclinE表达的变化;Southern blot和TRAP-PCR检测Sca-1~+HSCs端粒长度与端粒酶活性,以阐明ox-LDL体外诱导Sca-1~+HSCs衰老及ASP体外调控Sca-1~+HSCs衰老的生物学机制。 4. X线3.0Gy/8F全身均匀照射(total body irradiation,TBI)小鼠,采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析、甲基纤维素半固体培养等方法,观察X线TBI对小鼠对Sca-1~+HSCs衰老生物学特性的影响,以建立小鼠Sca-1~+HSCs体内衰老模型。 5.小鼠X线3.0Gy/8F全身均匀照射期间给予ASP灌胃,采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析及甲基纤维素半固体培养观察衰老生物学指标的变化;酶学比色法测定Sca-1~+HSCs总抗氧化能力(totalanti-oxidant,T-AOC);免疫荧光检测Sca-1~+HSCs内ROS水平;荧光定量PCR及Western blot检测HSCs衰老相关基因p16、p21mRNA及细胞周期调控蛋白P16、P21、CDK2、CDK6、cyclinD及cyclin E表达的变化;Southern blot和TRAP-PCR测定Sca-1~+HSCs端粒长度与端粒酶活性,以阐明3.0Gy/8F的X线TBI体内诱导Sca-1~+HSCs衰老及ASP体内调控Sca-1~+HSCs衰老的生物学机制。 结果 1. MACS分离纯化后Sca-1~+细胞纯度为(86.216.17)%,显著高于分离纯化前Sca-1~+细胞百分比为(11.451.87)%;台盼蓝染色法测定分选的Sca-1~+HSCs活性为(93.65±4.54)%。表明分选的Sca-1~+HSCs细胞有较高的纯度和良好的活性。 2. ox-LDL体外诱导Sca-1~+HSCs呈现典型的衰老生物学表现:SA-β-Gal染色阳性细胞率明显增加;增殖能力明显减弱; G1期细胞比例显著升高、S期细胞比例显著减少;混合集落形成单位(colonyforming unit-mixture,CFU-Mix)数量显著减少。ox-LDL可诱导衰老Sca-1~+HSCs培养上清液SOD、GSH-Px活性下降及MDA含量升高;细胞内ROS水平增加;端粒长度缩短,端粒酶活性降低;p16、p21mRNA及蛋白表达增强,CDK4、cyclinD及cyclinE蛋白表达降低,而对CDK2蛋白表达无影响。 3. ASP体外作用于衰老Sca-1~+HSCs可降低其SA-β-gal染色阳性细胞率、G1期细胞比例及P16表达;增加S期细胞比例及CDK4、cyclinD蛋白表达;抑制端粒DNA损伤;而对CFU-Mix数量、ROS水平、细胞培养上清液SOD、GSH-Px活性与MDA含量、P21、CDK2、cyclinE蛋白表达及端粒酶活性均无明显影响。 4. X线3.0Gy/8F全身均匀照射诱导小鼠Sca-1~+HSCs呈现典型的衰老生物学表现:SA-β-Gal染色阳性细胞率明显增加; G1期细胞比例显著升高,S期细胞比例显著减少;CFU-Mix数量显著减少。3.0Gy/8F的X线可诱导衰老Sca-1~+HSCs T-AOC下降,ROS水平增加;端粒长度缩短、端粒酶活性降低;p16、p21mRNA及蛋白表达增强,CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表达降低,而对CDK2蛋白表达无影响。 5. ASP体内作用于衰老Sca-1~+HSCs后可降低其SA-β-gal染色阳性细胞率下降及G1期细胞比例、增加S期细胞比例及CFU-Mix数量;增加细胞T-AOC、降低ROS水平;抑制端粒DNA损伤,增强端粒酶活性;下调p16、p21mRNA及蛋白表达,上调CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表达,CDK2蛋白表达无显著性变化。 结论 1. MACS可有效分选小鼠Sca-1~+HSCs,分离纯化的Sca-1~+HSCs纯度较高,活性良好。 2.ox-LDL可作为一种体外复制Sca-1~+HSCs衰老模型的有效致衰剂。 3.ASP体外作用可通过调节部分细胞周期调控蛋白表达及抑制端粒DNA损伤延缓ox-LDL诱导的Sca-1~+HSCs衰老。 4.3.0Gy/8F的X线全身均匀照射小鼠可诱导Sca-1~+HSCs衰老以用于小鼠HSCs体内衰老模型的构建。 5. ASP体内作用可通过抑制氧化应激损伤、调节细胞周期调控蛋白表达、抑制端粒DNA损伤及端粒酶活性下降以延缓X线TBI诱导的小鼠Sca-1~+HSCs衰老。


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