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miRNA-21对大鼠糖尿病肾病TGF-β/Smad信号通路的调控机制研究

林莉  
【摘要】:目的探讨miRNA-21对大鼠糖尿病肾病TGF-β/Smad信号通路的调控作用及机制。 方法 一.体外细胞实验 1.通过实时荧光定量PCR检测高糖和低糖条件下培养的肾小管上皮细胞miRNA-21表达的差异。 2.用生物信息学方法,预测、筛选miRNA-21作用的靶基因,并分别构建野生型和突变型Smad7表达质粒,体外转染293T细胞,用双荧光素酶报告基因验证其靶基因。 3.构建miRNA-21过表达慢病毒,分别转染高低糖培养的肾小管上皮细胞,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白情况;用流式细胞仪检测其转染率;用实时荧光定量PCR检测转染后miRNA-21的表达量;用MTT法检测肾小管上皮细胞增殖情况;用Western blot检测TGF-β/Smad信号通路Smad7的表达情况。 二.动物实验 1.用三联法(先切除大鼠左肾后,用高糖、高脂饮食诱导2月,再小剂量腹腔注射STZ)构建SD大鼠糖尿病肾病模型。 2. SD大鼠分为DN组、miRNA-21过表达慢病毒组、空载病毒组、正常饮食组。连续3次空腹血糖≥7.0mmol/L,24h尿蛋白>140mg/L视为建模成功。 3.通过尾静脉注射miRNA-21过表达慢病毒及空病毒。 4.1月后处死大鼠,取血查尿素氮。 5.用实时荧光定量PCR检测miRNA-21在肾组织中的表达。 6.用HE染色、PAS染色观察肾脏形态学改变;用透射电镜观察肾脏超微结构变化。 7.用免疫组织化学法检测Smad7、Smad2、Smad3蛋白的表达。 8.用Western blot检测肾组织中Smad7、Smad2、Smad3蛋白的表达并行比较。 结果 一.体外细胞实验 1.与低糖对照组相比,miRNA-21在高糖培养的肾小管上皮细胞中表达降低(p<0.05)。 2.根据生物信息学分析,Smad7可能是miRNA-21作用的靶基因,此预测在双荧光素酶报告基因中得到证实。 3.流式细胞仪检测结果显示:miRNA-21过表达慢病毒体外转染肾小管上皮细胞的转染率均在60%以上。 4.实时荧光定量PCR结果显示:高糖培养的肾小管上皮细胞转染过表达慢病毒后,miRNA-21的表达显著上调(p<0.05)。 5. MTT法结果显示:在转染miRNA-21过表达慢病毒的肾小管上皮细胞中,高、低糖细胞转染组的细胞增殖能力低于高糖细胞组及空病毒对照组(p<0.05)。 6.Western blot结果显示:转染miRNA-21过表达慢病毒后Smad7蛋白的表达低于高糖空病毒组、低糖组和高糖组(p<0.05)。 二.动物实验结果 (一)、糖尿病肾病模型成功 1.空腹血糖:正常组空腹血糖平均值为4.637mmol/L,均<7mmol/L。3组实验组空腹血糖平均值为13.04mmol/L,均≥7.0mmol/L。 2.肾功能情况 2.124小时尿蛋白正常组24小时尿蛋白平均值为118mg/L,均<140mg/L。3组实验组24小时尿蛋白平均值为313mg/L,均>140mg/L。 2.2尿素氮正常组:尿毒氮平均值为6.2mmol/L,均<8.2mmol/L。 3组实验组:尿毒氮平均值12.1mmol/L,均>8.2mmol/L。 (二)、qPCR结果显示:注入过表达慢病毒后肾脏组织的miRNA-21的表达比空病毒组和DN组升高,差异有显著性(P<0.05)。 (三)、形态学改变 1. HE染色结果 正常组:肾脏组织结构正常,未见系膜细胞、系膜基质增生,基底膜无增厚,肾小球大小正常,肾小管未见病变。 DN组:肾小球肿胀、系膜基质增生,伴少量系膜细胞增生,肾小管上皮肿胀。 miRNA-21慢病毒组:肾小球系膜细胞增生不明显,少量系膜基质增生,肾小管上皮细胞空泡变性。 空病毒组肾组织病变类似于DN组。 2. PAS染色结果 正常组:未见系膜细胞、系膜基质增生,基底膜无增厚,肾小球大小正常,肾小管未见病变。 DN组:肾小球肿胀、伴少量系膜细胞增生,肾小管上皮细胞肿胀,系膜基质增生。 miRNA-21慢病毒组:肾小球系膜细胞增生不明显,少量系膜基质增生,肾小管上皮细胞空泡变性 空病毒组肾组织病变与DN组相似。 3.投射电镜结果 正常组:肾脏组织结构正常,肾小球形态完好,基底膜、足突结构清晰,肾小管上皮细胞正常。 DN组:足突融合,基底膜增厚,溶酶体数量增多。 miRNA-21慢病毒组:系膜细胞泡沫化,增生,局部基底膜增厚,溶酶体数量增多,足突融合,肾小管正常,无免疫复合物沉积。 空病毒组:可见足突融合,基底膜增厚,近端小管溶酶体增多,远端小管:微绒毛少。 (四)、免疫组织化学法结果: Smad7在正常组的胞浆呈弱阳性反应;在DN组及空病毒组,呈强阳性反应,胞浆可见到深棕褐色着色;在miRNA-21慢病毒组呈弱阳性反应,胞浆棕黄色着色明显减少(P<0.05)。 Smad2、Smad3在正常组的胞浆均呈阴性反应;在DN组及空病毒组,呈弱阳性反应,胞浆可见到棕黄色着色;在miRNA-21慢病毒组呈阴性反应,胞浆未见棕黄色着色(P<0.05)。(五)、Western blot结果显示:肾组织的Smad7、Smad2、Smad3蛋白的表达均较空病毒组、DN组明显降低((P<0.05)。 结论 1.miRNA-21在体外可以抑制肾小管上皮细胞的增殖,抑制Smad7蛋白的表达。 2.miRNA-21在体内可以缓解大鼠的DN进展,可能是通过抑制Smad7、Smad2、Smad3蛋白的表达来实现的。干预这一过程可能是一个预防和治疗DN的新途径。


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