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实验性自身免疫性脑脊髓膜炎小鼠中枢神经系统中IL-27对CCL5表达的影响

燕伟平  
【摘要】:背景与目的:多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一种中枢神经系统(Central nervous system,CNS)自身免疫性疾病,炎症反应在其疾病发生和发展过程中起着重要的作用。白细胞介素-27(Interleukin-27,IL-27)是近年来新发现的IL-12家族成员之一,主要由激活的抗原递呈细胞APC、巨噬细胞和树突状细胞DCs分泌产生。自IL-27被发现以来,已显示出在免疫反应调控中的独特作用:诱导Th1细胞的分化,抑制Th2细胞和Th17细胞的发育;在高度Th1细胞极化时,IL-27的主要作用是限制Th1型免疫反应的强度和持续时间,从而保护机体免受过度的免疫反应的损伤,同时具有促炎与抗炎的双重特征。炎症性趋化因子5(RANTES/CCL5)是T淋巴细胞产生的炎性趋化因子之一,可以诱导白细胞粘附并穿过血脑屏障(Blood-brainbarrier,BBB)进入CNS,从而引起一系列的炎症反应和继发病变。研究发现,在缓解-复发型MS中,抑制CCL5的表达可以预防疾病的复发。目前,有很多国内外研究及报道提示,在自身免疫性炎症性疾病中,机体内IL-27和CCL5存在一定的相关性,但目前并无其具体机制的相关研究及报道。本实验通过在体实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(experimental autoimmune cerebrospinal meningitis,EAE)模型和离体培养腹腔巨噬细胞探索CCL5在EAE病变进程中受IL-27的变化调控的影响,并探索其机制,为预防MS的疾病进展和复发提供临床指导。 方法: 第一部分:将40只健康雌性C57BL/6小鼠用MOG31-55多肽免疫后0d、7d、15d、21d(每组10只),每天测其体重并观察老鼠行为学变化,用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin staining,HE)观察小鼠CNS中的炎症情况;用Western bloting(WB)和免疫组织化学方法测量IL-27和CCL5在中枢神经系统的表达。将50只C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、EAE组、IL-27+EAE组、SC144(IL-27受体拮抗剂)+EAE组、PBS(磷酸缓冲液)+EAE组,用WB和PCR方法测量CCL5的表达量。 第二部分:用3%巯基乙酸盐(每只1毫升)腹腔注射C57BL/6小鼠3d后,取小鼠腹腔巨噬细胞。分别对原代小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞株进行培养,加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)炎性刺激因子诱导mCCL5的表达,加入重组IL-27和SC144进行干预调控,收取细胞用realtime PCR测定CCL5mRNA的表达量及半衰期,用WB测量IFN-γ和NF-κB的蛋白表达;收取细胞培养液,用ELISA测定CCL5的表达量。 结果: 1、EAE小鼠最早在免疫后12天开始发病,大多数均集中在14~18天发病,并于2~4天后达到疾病高峰,在发病高峰期时神经功能评分均数为2.38±0.52。 2、HE染色示正常组小鼠脊髓无明显炎性细胞浸润;模型组炎性细胞浸润明显,血管周围有明显炎性细胞浸润,呈典型“血管袖套样”改变,且实质内亦有明显炎症细胞浸润,浸润的细胞类型以淋巴细胞为主,也可见少量胶质细胞。 3、在EAE疾病的过程中,EAE小鼠脑白质中IL-27的表达量逐渐增高;而CCL5的表达量先升高后降低。与EAE模型组和对照组相比,IL-27干预组神经功能评分明显较降低,疾病高峰期相对延后,CCL5表达水平明显受到抑制(P0.05);SC144干预组神经功能评分明显较高,疾病高峰期相对提前,CCL5表达水平明显升高(P0.05)。 4、在细胞水平,与正常对照组相比,LPS组、LPS+IL-27刺激组、LPS+SC144+IL-27组CCL5的表达均增多;与LPS刺激组和LPS+SC144+IL-27组比较,LPS+IL-27刺激组CCL5mRNA表达明显下降(P0.05),CCL5mRNA的半衰期缩短(P0.05)。 5、与正常对照组相比, LPS组、 LPS+IL-27刺激组、LPS+SC144+IL-27组IFN-γ和NF-κB的表达均增多(P0.05);与LPS刺激组和LPS+SC144+IL-27组比较,LPS+IL-27刺激组IFN-γ和NF-κB表达明显下降(P0.05)。 结论:在小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎疾病进展期,IL-27加速CCL5mRNA的半衰期,从而在mRNA和蛋白水平抑制CCL5的表达,并发挥抗炎作用,其具体机制至少部分是基于抑制IFN-γ的表达实现的。鉴于CCL5诱导白细胞粘附并穿过血脑屏障进入CNS引起一系列的炎症反应和继发病变,干预IL-27的表达为抑制多发性硬化MS疾病进展并预防疾病复发提供新的临床指导。


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