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1、当归多糖拮抗D-半乳糖致大鼠脑衰老及机制的研究 2、当归多糖对衰老模型大鼠脾脏结构与功能的影响

张梦思  
【摘要】:目的:衰老生物学与延缓衰老是社会科学和自然科学共同关注的重大研究问题,其中脑衰老是机体衰老的重要研究内容之一。课题组既往研究认为,脑衰老与神经干细胞衰老密切相关,我们既往研究证明,采用中医“补气”途径能延缓脑衰老和神经干细胞衰老,可见从天然药物中寻找延缓脑衰老或防治神经系统退行性疾病新途径值得高度关注。当归是中医临床“补血、活血”要药,已有千年临床应用历史。现代医学证明,当归多糖(ASP)是当归的重要药效成分,它具有抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、增强免疫功能、促进造血和延缓干细胞衰老等功效。迄今,有关ASP能否延缓机体衰老,尤其是延缓脑衰老还未见报道。衰老在中医学理论中属于虚损范畴,如气虚血瘀衰老学、肾虚血瘀衰老学、脾肾两虚夹瘀衰老学等,推测通过中医“补血活血”或“补血益气”途径可以延缓衰老和拮抗致衰因素损伤。本课题将传统中医学衰老理论和现代医学衰老理论相结合,采用现代生物学研究方法,通过复制脑衰老动物模型及神经干细胞体外衰老模型,探讨ASP延缓脑衰老与调控神经干细胞衰老的关系,旨在阐释通过“补血益气”途径延缓脑衰老和调控神经干细胞的衰老机理,为神经系统退行性疾病的防治提供理论与新思路。方法一、随机将40只3月龄SD大鼠分为4组,衰老模型组:大鼠颈背部连续皮下注射D-半乳糖(120mg/kg) qd×42; ASP衰老模型组注射D-半乳糖剂量与时间同衰老模型组,第15 d起腹腔注射ASP (100 mg/kg) qd×28;正常对照组皮下注射等量生理盐水qdX42; ASP对照组注射等量生理盐水qd×14,第15 d起腹腔注射ASP(同ASP衰老模型组)。各组大鼠处死前1天腹腔每4 h注射一次BrdU (50 mg/kg),共注射3次。通过以下检测探讨当归多糖拮抗脑衰老的体内作用及机制:1. Morris水迷宫进行空间学习、记忆行为学检测;2.衰老相关指标β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色;3. ELISA检测海马区炎症因子IL-1β, IL-6, TNF-α;4.检测海马内抗氧化能力;5. Southern blotting检测端粒长度;6. TRAP-PCR银染检测端粒酶活性测定;7.免疫荧光染色BrdU、GFAP、β-Ⅲ tubulin。二、从SD胎鼠脑组织中分离提取细胞进行原代培养,流式细胞术及Nestin免疫荧光鉴定神经干细胞(NSCs) 。将第3代NSCs分为对照组(常规培养);衰老组(加10 mg/ml的D-半乳糖);ASP组(按对照组处理后,加100μg/ml ASP,);ASP抗衰老组(按衰老组处理后,加100 μg/ml ASP),各组培养48 h。通过以下检测探讨当归多糖拮抗神经干细胞衰老的体外作用及机制:1. SA-p-Gal染色显示衰老神经球,计算阳性神经球百分比;2.流式细胞术检测神经干细胞内ROS水平与比色法测定丙二醛(MDA)的含量;3.PCR方法检测NSCs衰老相关基因p19、p21、p53 mRNA的表达水平。结果1.与衰老模型组相比,ASP衰老模型组大鼠学习记忆能力显著改善;脑切片SA-β-Gal染色光密度值显著降低;海马SOD、GSH-Px活性,GSH消耗量显著升高,MDA含量显著降低;海马区IL-1β, IL-6, TNF-α表达水平显著降低;脑组织端粒长度增长,端粒酶活性增高;β-tubulin Ⅲ+数目显著增加,GFAP数目显著减少,BrdU+细胞总数有所增加。2.成功分离鉴定神经干细胞,细胞Nestin免疫荧光染色呈阳性反应。与衰老组相比,ASP抗衰老组新形成的神经球的数量显著增加;SA-β-Gal染色阳性神经球百分率降低;细胞内MDA含量、ROS水平明显降低;衰老相关基因p19、p21、p53 mRNA表达水平降低。结论1.注射D-gal皂复制大鼠衰老模型和构建脑衰老模型。2.ASP具有拮抗D-gal所致大鼠脑衰老的作用。3.ASP可能通过调控脑组织细胞端粒系统,降低脑组织炎症因子表达水平和提高脑组织细胞抗氧化能力,进而拮抗致衰剂对脑的致衰老作用。4. D-gal能在体外诱导神经干细胞衰老,ASP能拮抗致衰剂诱导的神经干细胞衰老。目的探讨当归多糖(ASP)对衰老模型大鼠脾脏结构与功能影响及其机制,为寻找延缓免疫系统衰老的天然药物及其有效成分提供理论和实验依据。方法sD大鼠随机分为正常对照组,ASP对照组,衰老模型组,ASP衰老模型组,每组10只。衰老模型组皮下注射D-半乳糖(120mg/kg) qdX42;ASP衰老模型组注射D-半乳糖剂量与时间同衰老模型组,第15d起腹腔注射ASP (100 mg/kg) qd×28;正常对照组皮下注射等量生理盐水qd×42;ASP对照组注射等量生理盐水qd×14,第15d起腹腔注射ASP(同ASP衰老模型组)。药物注射完成后第2d,取脾脏测定脾指数,石蜡切片观察脾脏显微形态学,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测脾细胞衰老情况,CCK-8检测脾细胞对刀豆蛋白A刺激的增殖能力,流式细胞术检测脾细胞细胞周期,ELISA检测脾细胞分泌TNF-α、GM-CSF能力与细胞活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量,Western Blotting检测细胞衰老相关蛋白P53、P21、RB的变化。结果与正常对照组比较,D-半乳糖致衰老模型组大鼠脾指数,脾脏白髓面积比例,脾细胞对刀豆蛋白A刺激的增殖能力,S期比例及TNF-α、GM-CSF的分泌能力,SOD活性明显降低;脾细胞的SA-β-Gal日性率,G1期与G2/M期细胞比例,ROS、MDA含量,P53、P21、RB蛋白表达显著增高。与衰老模型组比较,ASP使D-半乳糖致衰老模型大鼠脾指数,脾脏白髓面积比例,脾细胞对刀豆蛋白A刺激的增殖能力,S期比例与TNF-a、 GM-CSF的分泌能力,SOD活性明显提高;脾细胞SA-β-Gal阳性率,G1期及G2/M期细胞比例,ROS、MDA含量,P53、P21、RB蛋白表达有显著抑制作用。结论D-半乳糖复制的衰老模型大鼠脾脏结构与功能损伤明显,当归多糖对其致衰损伤有明确的保护作用。


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