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1.当归多糖调控Wnt/β-catenin信号通路与延缓造血干/祖细胞衰老机理的研究 2.当归多糖对衰老模型大鼠骨髄造血功能的影响及机理研究

张岩岩  
【摘要】:目的干细胞衰老是生物体衰老的最新学说和老年性疾病的关键原因,寻找调控干细胞衰老的途径对延缓机体衰老和防治老年性疾病至关重要。造血干/祖细胞(HSC/HPCs)衰老与多种老年性疾病密切相关。我们已证明,当归多糖(ASP)是当归重要的抗衰老成分,采用“补血益气”途径能调控和延缓HSC/HPCs衰老;能拮抗和修复致衰剂对HSC/HPCs的损伤;能有效保护免疫系统和造血系统功能。迄今,ASP调控HSC/HPCs衰老的研究仅见本课题组报道,但其分子机理还不清楚。本课题将干细胞衰老最新理论和技术与中医学衰老理论和对干细胞认识紧密结合起来,通过构建HSC/HPCs体内/外衰老模型,研究ASP延缓HSC/HPCs衰老与调控Wnt/β-catenin信号通路关键靶点的分子机制。方法1.小鼠造血干/祖细胞分离与鉴定:提取骨髓单个核细胞,免疫磁性分选技术(MACS)分离、纯化骨髓Sca-1+HSC/HPCs,流式细胞术鉴定分选细胞的纯度。2.体外实验分五组:分离纯化的Sca-1+HSC/HPCs分为:对照组;衰老模型组;信号通路阻断剂组;抗氧化剂组;ASP抗衰老组。分别处理各组细胞后检测以下指标:1)衰老相关生物学指标检测:①衰老相关β半乳糖苷酶(SA-p-Gal)染色;②细胞培养上清中晚期糖基化终产物(AGEs)含量检测,③造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养;④衰老相关基因p16、p21 mRNA及P16、P21、P53及Rb蛋白表达检测;2)氧化指标检测:①细胞内活性氧(ROS)水平与细胞总抗氧化能力(T-AOC)检测;②DNA和脂质氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)和4-羟基壬烯醛(4-HNE)含量检测;3) Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白与基因检测:包括β-catenin、GSK-3β蛋白表达和定位检测,β-catenin、GSK-3β、Phospho-GSK-3β、TCF-4表达检测β-catenin、c-myc mRNA表达检测。3.体内实验分四组:小鼠随机分为,衰老模型组;ASP衰老模型组;维生素E衰老模型组和对照组。分别处理各组小鼠,检测指标同体外实验。结果1.分离纯化前Sca-1+细胞为11.83±3.05%,经MACS分离纯化后Sca-1+细胞纯度为89.83±4.26%。表明分选后的Sca-1+HSC/HPCs纯度高、活性良好。2.体外实验结果表现:①衰老模型组与对照组比较,Sca-1+HSC/HPCs的SA-β-Gal染色阳性细胞率提高,细胞培养上清中AGEs含量增加,CFU-Mix形成数量下降,衰老相关基因p16、p21mRNA及P16、P21、P53和Rb蛋白表达增加;ROS水平、8-OHDG和4-HNE含量上升,T-AOC下降;细胞质β-catenin表达量增加,且向细胞核内转移增多;GSK-3β表达量减少;Phospho-GSK-3p及TCF-4蛋白,β-catenin及c-myc mRNA表达增加。②信号通路阻断剂组与衰老模型组比较,Sca-1+HSC/HPCs细胞质内β-catenin表达量减少,且细胞核内表达减少;GSK-3β表达量增加;Phospho-GSK-3β及TCF-4蛋白,βcatenin及c-myc mRNA表达减少;SA-β-Gal染色阳性细胞率提高和细胞培养上清中AGEs含量增加,CFU-Mix形成数量减少;衰老相关基因p16、p21 mRNA及P16、P21.P53及Rb蛋白表达显著下降;其余指标无显著性变化。③抗氧化剂组与衰老模型组比较,Sca-1+HSC/HPCs的SA-β-Gal染色阳性细胞率和细胞培养上清AGEs含量下降,衰老相关基因p16、p21mRNA及P21、Rb蛋白表达显著下降;胞质内β-catenin表达量减少,且细胞核内含量下降;GSK-3β表达量增力;Phospho-GSK-3β及TCF-4蛋白,β-catenin及c-myc mRNA表达减少;Sca-1+HSC/HPCs内ROS水平、细胞培养上清中8-OHDG和4-HNE含量下降,T-AOC显著上升;其余指标无显著性变化。④ASP抗衰老组与衰老模型组比较,Sca-1+ HSC/HPCs SA-β-Gal染色阳性细胞率和细胞培养上清AGEs含量减少,CFU-Mix数量增加,衰老相关基因p16.p21 mRNA及P16.P21.P53及Rb蛋白表达下降;Sca-1+HSC/HPCs内ROS水平、细胞培养上清中8.OHDG和4-HNE含量下降,T-AOC上升;胞质内β-catenin表达量减少,且细胞核内含量减少;Phospho-GSK-3β及TCF-4蛋白,β-catenin及c-myc mRNA表达减少。3.体内实验结果表现:①衰老模型组较对照组Sca-1+HSC/HPCs的SA-β-Gal染色阳性细胞率和AGEs含量增加,CFU-Mix形成数量减少,衰老相关基因p16.p21 mRNA及P16.P21.P53及Rb蛋白表达增加;Sca-1+HSC/HPCs内ROS水平、血清中8.OHDG和4-HNE含量上升,T-AOC显著下降;细胞质β-catenin表达量增加,且向细胞核内转移增多:GSK-3p表达量减少;Phospho-GSK-3β及TCF-4蛋白,β-catenin及c-myc mRNA表达增加。②ASP衰老模型组与衰老模型组比较,Sca-1+HSC/HPCs的SA-β-Gal染色阳性细胞率和细胞培养上清AGEs含量降低,CFU-Mix形成数量增加,衰老相关基因p16、p21 mRNA及P16、P21.P53及Rb蛋白表达下降;Sca-1+HSC/HPC s内ROS水平、细胞培养上清中8-OHDG和4-HNE含量下降,T-AOC显著上升;胞质内β-catenin表达量减少,且细胞核内含量减少;Phospho*GSK-3β及TCF-4蛋白,β-catenin及c-myc mRNA表达减少。③维生素E衰老模型组较衰老模型组,Sca-1+HSC/HPCs的SA-β-Gal染色阳性细胞率降低;Sca-1+HSC/HPCs内ROS水平、8-OHDG和4-HNE含量下降,T-AOC上升;其余指标无显著性变化。结论1.ox-LDL是一种理想的致衰剂,它可通过与Wnt/β-catenin信号通路的辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRPS5/6)结合激活该通路,从而调控p16INK4a/Rb口p53/p21通路,最终诱导Sca-1+HSC/HPCs衰老。2.ASP可通过抑制由氧化应激介导的Vnt/β-catenin信号通路激活,延缓Sca-1+HSC/HPCs衰老。目的探讨当归多糖(ASP)对衰老模型大鼠骨髓造血功能的影响及其机理,为寻找延缓骨髓造血功能衰老的天然药物提供理论和实验依据。方法6-8周雄性SD大鼠40只,随机分为正常组(n=10)、ASP正常组(n=10)、衰老模型组(n=10)和ASP衰老模型组(n=10)。药物注射完成第2d,取眼球血检测外周血常规,取股骨测定每根股骨单个核细胞(BMNCs)总数;CCK8测定BMNCs增殖能力;流式细胞术检测BMNCs增殖周期与活性氧簇(ROS)含量;造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养检测BMNCs形成集落能力;衰老p半乳糖苷酶(SA-p-Gal)染色观察衰老BMNCs百分率;酶学法检测细胞总抗氧化能力(T-AOC);Western blotting检测P53和P21蛋白表达;激光共聚焦检测P53蛋白表达及定位。结果与衰老模型组比较,ASP衰老模型组外周血红细胞、血小板和白细胞总数下降得到抑制;股骨BMNCs细胞数升高;增殖能力提高;形成CFU-Mix数增加;SA-β-Gal染色阳性BMNCs百分率显著降低; G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高,细胞内ROS含量显著降低;T-AOC升高;P53和P21表达显著上调。结论ASP能延缓或拮抗D-半乳糖致大鼠骨髓造血细胞衰老,其机理可能与ASP抑制氧化应激,下调p53/p21通路有关。


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