收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

1,25(OH)_2D_3对mTOR介导的早期糖尿病肾病的干预及保护作用的研究

王行  
【摘要】:第一部分1,25(OH)_2D_3抑制高糖介导的大鼠肾小球系膜细胞的增殖作用的研究目的:观察高糖对大鼠肾小球系膜细胞增殖及肥大的影响;摸索高糖及1,25(OH)_2D_3对肾小球系膜细胞的最佳干预条件;观察1,25(OH)_2D_3对高糖介导的肾小球系膜细胞增殖的影响。方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1),用不同浓度葡萄糖培养HBZY-1细胞:(1)正常葡萄糖浓度组(normal glucose,NG):葡萄糖浓度为5.5mmol/L培养基进行HBZY-1细胞培养;(2)高葡萄糖浓度组15(high glucose,HG15):葡萄糖浓度为15mmol/L培养液进行HBZY-1细胞培养;(3)高葡萄糖浓度组25(high glucose,HG25):葡萄糖浓度为25mmol/L培养液进行HBZY-1细胞培养;(4)高葡萄糖浓度组35(high glucose,HG35):葡萄糖浓度为35mmol/L培养液进行HBZY-1细胞培养。光镜下观察细胞直径变化,台盼蓝拒染法观察细胞增殖情况,确定体外模拟糖尿病肾病的最佳葡萄糖干预浓度;MTT法检测1,25(OH)_2D_3对高糖介导的HBZY-1细胞增殖的抑制作用,确定1,25(OH)_2D_3干预HBZY-1细胞的最佳条件;Lenti-sh VDR转染入HBZY-1细胞,RT-PCR及western blot分别检测包含4条干扰序列的Lenti-sh VDR的m RNA及蛋白表达水平,筛选Lenti-sh VDR的最佳干扰序列。细胞随机分组为:(1)正常葡萄糖浓度组(normal glucose,NG):葡萄糖浓度为5.5mmol/L培养基进行HBZY-1细胞培养。(2)高葡萄糖浓度组(high glucose,HG):用高浓度葡萄糖配制培养基,进行HBZY-1细胞培养。(3)高葡萄糖浓度+1,25(OH)_2D_3干预组(HG+1,25(OH)_2D_3,HV):在高糖培养的基础上,向培养基中加入1,25(OH)_2D_3共培养。(4)高葡萄糖浓度+Lenti-sh VDR组(HG+Lenti-sh VDR,HL):用高浓度葡萄糖培养经Lenti-sh VDR转染后的HBZY-1细胞。(5)高葡萄糖浓度+Lenti-sh VDR+1,25(OH)_2D_3干预组(HG+Lenti-sh VDR+1,25(OH)_2D_3,HLV):在高糖培养转染Lenti-sh VDR的HBZY-1细胞的基础上,向培养基中加入1,25(OH)_2D_3共培养,流式细胞周期法检测各组细胞的增殖情况,观察1,25(OH)_2D_3对高糖介导的肾小球系膜细胞增殖的影响。结果:(1)倒置显微镜下,HBZY-1细胞在传代后48小时呈贴壁生长,长梭形,透明,折光性好,大小均一,形态一致。但随着葡萄糖干预浓度的增高,细胞密度逐渐增大,偶见发亮的漂浮细胞。当葡萄糖浓度达到35mmol/L时,细胞增殖反而被抑制,且漂浮细胞增多。比较各组细胞的直径后发现,HG25组及HG35组的HBZY-1细胞相较NC组出现了明显的增大(P0.05)。台盼蓝拒染实验结果显示,NG组、HG11组在各时间点对HBZY-1细胞无明显的增殖促进作用;与NG组相比,HG25组在48小时开始对HBZY-1细胞的增殖有促进作用,再增高葡萄糖浓度,HG35组的细胞增殖反而被抑制(P0.05)。(2)MTT法检测结果显示,1,25(OH)_2D_3对高糖介导的HBZY-1细胞增殖的抑制作用呈时间浓度依赖性,当浓度达到1μM/L时其抑制作用最大化;而当1,25(OH)_2D_3干预时间达到24小时时,HBZY-1细胞的增殖出现有统计学意义的降低,再延长干预时间至36小时,其抑制作用并没有进一步增强(P0.05)。(3)流式细胞周期法检测结果显示,HG组HBZY-1细胞的S期相比NC组出现了明显增高,而HV组细胞的S期较HG组明显降低,同时HL及HLV组细胞的S期则较HV组明显上升(P0.05)。结论:葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞体外模拟糖尿病肾病的最佳干预浓度为25mmol/L,1,25(OH)_2D_3干预肾小球系膜细胞的最佳条件为1μM/L干预24小时,1,25(OH)_2D_3能够有效抑制高糖介导的肾小球系膜细胞的增殖。第二部分1,25(OH)_2D_3对早期糖尿病肾病模型大鼠肾脏的保护作用研究目的:观察1,25(OH)_2D_3和Lenti-sh VDR单独或联合干预对早期糖尿病肾病模型大鼠肾脏功能的影响。方法:构建大鼠糖尿病肾病模型,随机分组为:(1)正常对照组(normal control,NC组);(2)糖尿病肾病组(diabetic nephropathy,DN组);(3)糖尿病肾病+1,25(OH)_2D_3干预组:(DN+1,25(OH)_2D_3,DV组);(4)糖尿病肾病+Lenti-sh VDR干预组(DN+Lenti-sh VDR,DL组);(5)糖尿病肾病+Lenti-sh VDR+1,25(OH)_2D_3干预组:(DN+Lenti-sh VDR+1,25(OH)_2D_3,DLV组)。检测每组大鼠体重、肾重、空腹血糖、血压、血脂、血钙;Elisa法检测大鼠的血和尿中白蛋白、血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、甲状旁腺激素(PTH)、25(OH)D水平;荧光显微镜下观察Lenti-sh VDR转染大鼠情况;光镜下观察各组大鼠肾脏病理改变,计算肾脏总体积、平均肾小球体积;透射电子显微镜下观察各组大鼠肾脏改变,测量肾小球基底膜厚度。结果:(1)DN组体重相比NC组出现了明显的减轻,而DN组的肾脏重量(KW)及肾脏与体重的比值(KW/BW)则明显高于NC组。在应用了1,25(OH)_2D_3干预后此效应有所减弱。血压的比较在5组大鼠之间没有显著的差异。DN组的大鼠空腹血糖(FPG)、血浆总甘油三酯(TG)及24小时尿白蛋白水平明显高于NC组。DV组大鼠24小时尿白蛋白水平相比DN组有所减弱。DN组大鼠的血清HMGB1水平明显高于NC组,而DL及DLV组大鼠则显著高于DV组大鼠。血钙及血清甲状旁腺激素水平在DN及NC组之间没有差异,而DL及DLV组相比NC组则出现了血钙的下降和甲状旁腺激素的升高。另外,DN组大鼠的血清25(OH)D水平与NC组及DV组大鼠相比都有明显下降,同时DL及DLV组大鼠的血清25(OH)D则比DV组明显升高(P0.05)。(2)无论是肝脏还是肾脏,DL及DLV组的大鼠组织切片在荧光显微镜下都可见荧光表达,而NC组、DN组及DV组则没有观察到荧光表达。(3)DN组大鼠的总肾体积较NC组大鼠有明显增大,而DV组大鼠的总肾体积则较DN组大鼠有明显减小。DN组、DL组及DLV组的平均肾小球体积(MGV)比NC组增大,而DV组的MGV比DN组明显减小。DN组、DL组及DLV组的肾小球基底膜(GBM)厚度较NC组明显增厚,而DV组的GBM则较DN组明显变薄(P0.05)。结论:1,25(OH)_2D_3能够有效降低早期糖尿病肾病模型大鼠的尿蛋白排泄,有效地减小早期糖尿病肾病模型大鼠的总肾体积、平均肾小球体积及肾小球基底膜厚度,改善及延缓糖尿病肾病的病理发展。且此效果可能依赖于与其维生素D受体(VDR)的结合。第三部分1,25(OH)_2D_3对mTOR介导的早期糖尿病肾病的干预机制的研究目的:探讨1,25(OH)_2D_3改善mTOR介导的早期糖尿病肾病的可能机制。方法:构建大鼠糖尿病肾病模型,随机分组为:(1)正常对照组(normal control,NC组);(2)糖尿病肾病组(diabetic nephropathy,DN组);(3)糖尿病肾病+1,25(OH)_2D_3干预组:(DN+1,25(OH)_2D_3,DV组);(4)糖尿病肾病+Lenti-sh VDR干预组(DN+Lenti-sh VDR,DL组);(5)糖尿病肾病+Lenti-sh VDR+1,25(OH)_2D_3干预组:(DN+Lenti-sh VDR+1,25(OH)_2D_3,DLV组)。RT-PCR检测各组大鼠的VDR、DDIT4的m RNA表达水平;western blot检测各组大鼠的VDR、DDIT4、TSC2、Akt、mTOR、P70S6K的蛋白及磷酸化表达水平。结果:(1)DN组大鼠VDR及DDIT4的m RNA表达较NC组明显降低,而DV组其表达较DN组明显升高;DL组及DLV组其VDR和DDIT4的表达较NC组明显降低(P0.05)。(2)DN组大鼠VDR及DDIT4的蛋白表达水平较NC组明显降低,而DV组其表达较DN组明显升高;DL组及DLV组其VDR和DDIT4的表达较NC组明显降低;与NC组相比,TSC2的磷酸化水平在DN组显著下降,而在DV组则显著上升;Akt的磷酸化水平则与TSC2截然相反。同时与NC组相比,mTOR及P70S6K的磷酸化水平在DN组明显升高,而在DV组则明显降低。另外我们还观察到,1,25(OH)_2D_3对mTOR的抑制作用在VDR基因沉默后消失(P0.05)。结论:1,25(OH)_2D_3能够有效诱导DDIT4的表达,并通过其表达抑制mTOR信号通路的活性;1,25(OH)_2D_3对mTOR的抑制依赖于与其受体VDR的结合。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王玉新,李大启,李公宝,徐琴君;糖尿病肾病患者血清可溶性白细胞介素6受体检测[J];上海免疫学杂志;2001年02期
2 宫雅南,刘冬年,熊玉冰,黄伟文,庄万江;糖尿病足患者糖尿病视网膜病变分析[J];广东医学;2001年06期
3 顾芹,宋守君,李向阳,尤传一;胰激肽原酶肠溶片对早期糖尿病肾病的防治作用[J];中国临床药学杂志;2001年06期
4 曹爱华 ,王瑛 ,李翔;杏丁治疗早期糖尿病肾病疗效观察[J];辽宁实用糖尿病杂志;2001年03期
5 ;中药治疗糖尿病肾病新进展[J];中国中医药信息杂志;2001年04期
6 张桂茹;糖尿病肾病85例临床分析[J];陕西医学杂志;2002年02期
7 侯建明 ,林凤辉 ,张超群;46例2型糖尿病肾病与糖尿病自主神经病变的关系分析[J];福建医药杂志;2002年04期
8 陈文霖;糖尿病饮食[J];医疗保健器具;2002年Z1期
9 孙力,许玲;2型糖尿病患者糖尿病足的危险因素分析[J];山东医药;2002年35期
10 ;糖尿病肾病诊治研究进展[J];基础医学与临床;2003年04期
11 李蓓;生活在荷兰的印度后裔终末期糖尿病肾病发生率高[J];新医学;2003年01期
12 孙铸兴,缪建萍;2型糖尿病伴发原发性肾小球肾炎16例分析[J];江苏医药;2003年04期
13 刘红,杨卉;肾素血管紧张素系统与糖尿病肾病[J];安徽医药;2003年02期
14 翁建平;2型糖尿病对社会造成的负担不容忽视[J];广东医学;2003年10期
15 钱宁;血管内皮生长因子与糖尿病肾病[J];微循环学杂志;2003年01期
16 张洁,王立琴;黄连素治疗糖尿病的研究进展[J];中西医结合心脑血管病杂志;2003年03期
17 刘晓明,田京利,仲伟红,张丽彩,魏瑞平;军队休干所糖尿病患者糖尿病足情况调查分析[J];解放军保健医学杂志;2003年04期
18 董西刚,李伟;糖尿病肾病的病理与临床[J];实用医技杂志;2004年02期
19 蒋继宏,于晓明,邱雨华,杜丽洁;糖尿病肾病血液透析血管通路探讨[J];辽宁药物与临床;2004年02期
20 潘志红;糖尿病高血压病的防治[J];中国实用乡村医生杂志;2004年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张星;许筠;苏建平;张军;程立志;翟晓丽;;糖尿病肾病的临床疗效对比观察[A];第十九次全国中医肾病学术交流会论文汇编[C];2006年
2 杨家茂;;糖尿病肾病防治琐谈[A];全国第二届中医中西医结合肾脏病临床进展学术研讨会论文集[C];2007年
3 丁耀耿;郝桂霞;;糖尿病肾病临床分析[A];全国第二届中医中西医结合肾脏病临床进展学术研讨会论文集[C];2007年
4 张文铠;王志伏;王雪;孙大朋;;糖尿病肾病的治疗现状[A];中华中医药学会第二十一届全国中医肾病学术会议论文汇编(下)[C];2008年
5 倪青;;糖尿病肾病的中西医结合研究[A];第六届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2000年
6 孙怡;李健红;宗红燕;;黄芪桂枝五物汤加味治疗糖尿病肾病16例[A];第六届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2000年
7 叶军;;糖尿病肾病在儿童时期的早期干预[A];中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编[C];2001年
8 杜旭昶;孙志红;闫春芳;刘彩虹;;疏糖丹治疗2型糖尿病50例临床分析[A];第六次中国中西医结合糖尿病学术会议论文汇编[C];2002年
9 于世家;任平;马丽佳;李小娟;郑曙琴;武明东;刘自力;薛丽辉;;糖尿病住院患者1344例回顾性分析[A];第六次中国中西医结合糖尿病学术会议论文汇编[C];2002年
10 郝效槐;魏玫都;崔立俊;;中西并蓄治疗糖尿病肾病[A];第七次中国中西医结合糖尿病学术会议论文汇编[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王行;1,25(OH)_2D_3对mTOR介导的早期糖尿病肾病的干预及保护作用的研究[D];重庆医科大学;2016年
2 王晓杰;组蛋白去乙酰化酶4特异性促进糖尿病肾病足细胞损伤[D];山东大学;2015年
3 张永;MiR-346在抗TGF-β信号途径介导的糖尿病肾病发生和发展中的作用机制[D];武汉大学;2015年
4 魏凤江;高尿酸血症、2型糖尿病及糖尿病微血管病变的群体遗传学研究[D];天津医科大学;2015年
5 孙士杰;胱抑素C对2型糖尿病视网膜病变预测价值研究[D];山东大学;2015年
6 魏艳红;PKCα介导的EGFR降解在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用及机制[D];华中科技大学;2015年
7 龙泓竹;益气养阴通络散结方防治早期糖尿病肾病的临床及实验研究[D];北京中医药大学;2016年
8 姜旻;糖尿病肾脏疾病进展预测模型的建立与验证[D];北京中医药大学;2016年
9 王亚南;糖肾清2号抑制糖尿病肾病免疫炎性损伤机制的探讨及临床疗效分析[D];北京中医药大学;2016年
10 王岚;基于Klotho基因多态性对糖尿病肾病中医证候的研究[D];湖北中医药大学;2016年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 肖轶炜;2型糖尿病合并糖尿病肾病的发病率和危险因素研究[D];广西医科大学;2015年
2 张晓利;黄葵胶囊在糖尿病肾病中的作用及其机制[D];新乡医学院;2014年
3 柯辉;糖尿病合并高血压患者发生周围神经病变的危险因素分析[D];福建医科大学;2015年
4 吴晓鸿;临床蛋白质组学在糖尿病肾病研究中的应用[D];福建医科大学;2015年
5 庄勇;甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2与糖尿病肾病[D];福建医科大学;2015年
6 胡杨;超重及肥胖的糖尿病患者铁蛋白水平变化及相关因素分析[D];河北联合大学;2014年
7 张宝玉;2型糖尿病肾患者血清iFGF-23、α-Klotho蛋白、NLR、PLR水平的变化研究[D];北京协和医学院;2015年
8 曹耀辰;肝酶与糖尿病肾病的关系[D];延边大学;2015年
9 李秀兰;多塞平对2型糖尿病合并抑郁症作用的临床观察[D];泰山医学院;2014年
10 权香;PPAR-γ2基因C161T和Prol2Ala多态性与2型糖尿病及糖尿病肾病的相关性研究[D];延边大学;2015年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 向佳;糖尿病中医药防治项目立足社区[N];中国中医药报;2011年
2 特约记者 鲁海燕;逾八成公众存在糖尿病高危因素[N];家庭医生报;2013年
3 马明愈;现代生活方式导致 糖尿病发病率迅速上升[N];中国妇女报;2005年
4 省立医院内分泌科主任医师 侯建明;糖尿病肾病的防治[N];福建科技报;2004年
5 王文绢 范军星;世界糖尿病日关注焦点:糖尿病并发症[N];健康报;2003年
6 主持人 向红丁博士;糖尿病肾病须早防早治[N];人民政协报;2002年
7 华悦;预防糖尿病,从减肥开始[N];上海中医药报;2004年
8 刘冬梅;肥胖糖尿病第一诱因[N];天津日报;2004年
9 刘燕玲;首部中医专病指南定下糖尿病治则[N];健康报;2007年
10 崔昕;中药防治糖尿病肾病有进展[N];健康时报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978