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酒精影响APP代谢途径诱导神经性病变的机制研究

黄道超  
【摘要】:目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)常为散发性发病且多数诱因不明,据报道较多环境因素和饮食因素包括过量饮酒均会增加该患病风险,但目前关于酒精如何影响AD患者认知功能和病理学改变的机制仍需探究。本研究将从β淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)代谢途径探究酒精暴露与AD的关系,初探酒精干扰APP代谢途径影响β淀粉样蛋白(Amyloidβprotein,Aβ)产生的机制,分析酒精对机体神经性病变和学习记忆能力的影响。方法利用不同浓度梯度的酒精处理神经源性细胞(SH-SY5Y、SH105)和非神经源性细胞(HEK293、2EB2、20E2),然后采用CCK8法、蛋白免疫印迹、ELISA、荧光素酶活性检、RT-PCR、蛋白代谢实验等检测不同酒精浓度对不同细胞的细胞活性的影响,检测体外酒精暴露对APP代谢酶及Aβ水平的影响,以及探究暴露酒精对APP和β-位点-淀粉样前体蛋白剪切酶-1(Beta-site APP cleaving enzyme 1,BACE1)降解和合成的影响。同时利用6周龄APP23/PS45双转基因AD小鼠为研究模型,每天给予20%的酒精安赛蜜溶液自由饮用4小时,连续给予四周酒精处理,分别记录整个实验过程中,小鼠的酒精摄入量、体重、食物摄入量以及测量其在酒精处理后第7,14,21和28天小鼠血液中酒精浓度;并利用Morris水迷宫实验评估AD小鼠的空间学习记忆能力;采用蛋白免疫印迹和ELISA实验分析酒精暴露对机体APP代谢途径相关基因和Aβ产生的影响,采用Thioflavin-S荧光染色法和免疫组化实验检测机体Aβ沉积和老年斑等神经性病变与酒精暴露之间的关系。结果与对照组相比,经浓度为0.4,0.8,1.6,3.2,6.4和8 mg/ml酒精处理的HEK293中,细胞活性未表现出明显差异,而在经浓度为12,16和20mg/ml酒精处理的HEK293中,其细胞活性明显降低,经浓度为0.4,0.8,1.6,3.2和6.4 mg/ml酒精处理组中,细胞活性均未出现差异,但在8,12,16和20mg/ml酒精处理组中,SH-SY5Y细胞活性出现显著性差异。2EB2细胞经0,0.4,0.8,1.6,3.2和6.4mg/ml的酒精处理后,在1.6,3.2和6.4 mg/mL酒精处理组中APP、APP-CTFs和BACE1的表达均呈明显升高,解整合素样金属蛋白酶10(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10,ADAM10)和早老素-1蛋白(Presenilin-1,PS1)无差异性变化。20E2细胞中在1.6,3.2和6.4 mg/mL酒精处理组APP蛋白表达同样显著性增加,细胞上清液中Aβ40和Aβ42的浓度也明显增加。在神经源性细胞SH105中,0.8,1.6,3.2和6.4mg/mL酒精处理组APP和BACE1均出现显著性差异,且和非神经源性细胞2EB2和20E2中一样,ADAM10和PS1蛋白在SH105中各酒精处理组均无差异性变化。实验结果表明酒精暴露可影响APP和BACE1蛋白表达水平,促进Aβ产生,但不影响ADAM10和PS1蛋白水平。含APP启动子和含BACE1启动子质粒分别转染SH-SY5Y细胞,经0,0.4,1.6和3.2 mg/mL的酒精处理后通过荧光素酶活性分析,发现1.6和3.2 mg/mL的酒精处理组,明显增强了APP启动子和BACE1启动子活性。同时经酒精处理24h的SH-SY5Y细胞中内源性APP和BACE1的mRNA水平均升高,结果表明:酒精可能是通过增强APP和BACE1启动子活性和转录水平,从而来促进APP和BACE1蛋白表达。经放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理0,15,30和60分钟等不同时间点后,2EB2细胞中APP和BACE1蛋白代谢水平,即蛋白降解半衰期,与对照组的各个时间点均无显著性差异。结果表明酒精并不影响APP和BACE1蛋白的降解。酒精对小鼠脑组织中APP和Aβ的影响结果与在体外对细胞中影响一致,实验组小鼠脑组织中APP蛋白、BACE1蛋白和CTFβ片段水平均比对照组增加,ELISA检测实验组脑组织中Aβ40和Aβ42的浓度也明显上升,结果表明酒精会影响APP/PS45小鼠脑组织中APP代谢,促进Aβ产生。用4G8抗体对脑组织中Aβ沉积情况和老年斑数量进行免疫组化检测,结果显示实验组小鼠脑组织中老年斑明显增加,Thioflavin-S染色结果同样显示实验组小鼠比对照组小鼠老年斑数量明显增加,结果表明酒精会加速AD小鼠脑组织中Aβ沉积,促进老年斑的形成。酒精处理后的AD小鼠空间学习记忆能力通过Morris水迷宫实验检测。在可视平台实验期,实验组小鼠逃逸潜伏期和游向平台的距离与对照组无显著性差异;在隐匿平台实验期第一天和第二天,逃逸潜伏期和游泳距离均无显著性差异,而第三天和第四天实验组和对照组小鼠逃逸潜伏期和游泳距离均呈现显著性差异;在空间探索实验中,实验组小鼠与对照组比,其穿越平台的次数呈现明显差异。水迷宫实验结果表明,酒精暴露一定程度上影响了小鼠的空间学习记忆能力。结论酒精可通过增强APP和BACE1启动子活性和转录水平,从而促进APP和BACE1蛋白合成,但酒精并不影响APP和BACE1蛋白的降解。酒精在体内外均可影响APP代谢途径,促进Aβ产生,增加脑组织中老年斑的形成,损伤机体空间学习记忆能力,诱导神经性病变。酒精暴露是阿尔茨海默病发病的诱因之一,它会加速阿尔茨海默病的病程。


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