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ACK1对滋养细胞和血管内皮细胞功能的调控在子痫前期发病机制中的作用

刘洋铭  
【摘要】:目的:妊娠期高血压疾病是一种常见的危及母儿健康的产科并发症,它是一种妊娠期特有的全身性疾病,发病率约为5-10%。子痫前期是妊娠期高血压疾病分类中一种严重的并发症,其病理生理基础是全身小动脉痉挛。子痫前期的发病机制及进展过程目前是产科学界的一大难题,目前普遍公认的学说为胎盘浅着床、滋养细胞缺血、免疫失衡以及血管内皮细胞的损伤等。活化的Cdc42结合激酶(Activated Cdc42 associated kinase),又称ACK1或TNK2,是一种非受体型酪氨酸激酶,在调控细胞的细胞骨架、分裂周期、细胞运动和增殖等不同方面有着重要作用,同时,与不同信号通路之间存在紧密的关系。目前关于ACK1的研究主要集中在与肿瘤的恶性程度关系上。目前国内外尚未见到有关ACK1在人类胎盘发育过程中起到的作用的研究。故本课题研究目的在于:1.首先检测ACK1在早孕期和晚孕期胎盘(后者包括正常组和PE组)中的表达及定位情况;2.借助于HUVECs以及HTR8/Svneo细胞株对于ACK1的表达情况进行测定,并检测其对上述两种细胞的生物学功能的调控;3.对细胞给予缺氧/复氧(H/R)处理后,模拟PE初期的氧化应激损伤,探讨ACK1基因怎样通过PI3K/Akt通路对人脐静脉内皮细胞以及滋养细胞的功能进行调控,在这个基础上,分析其引起子痫前期发病的基本作用机制。实验方法:1.首先,我们使用IHC检测在人类晚孕期(N组和PE组)、早孕期胎盘(绒毛和蜕膜)中ACK1的定位和表达情况。2.采用WB和q RT-PCR研究N组和PE组胎盘组织中ACK1的表达及差异情况。3.使用慢病毒将ACK1 sh RNA转染HTR8/Svneo和HUVECs,干扰HTR8/Svneo、HUVECs细胞中ACK1蛋白量的表达,并采用WB、q RT-PCR以及IF判定是否干扰成功,同时,对于干扰效率进行检验。4.使用细胞迁移以及侵袭实验分析检测HTR8/SVneo细胞生物学功能由于下调ACK1而受到的影响。5.使用管腔成型实验以及细胞迁移实验测定HUVECs细胞生物学功能由于下调ACK1而受到的影响。6.使用WB检测TIMPs(TIMP1以及TIMP2)与MMPs(MMP2以及MMP9)的蛋白表达由于下调ACK1的表达而受到的影响。8.使用H/R模型模拟子痫前期滋养细胞氧化应激损伤(oxidative stress,OS),检测HTR8/Svneo和HUVECs受到H/R损伤后生物学功能的改变,以及H/R损伤对ACK1表达的调控。9.当H/R损伤存在时,通过对ACK1进行敲降和阻断其相关PI3K/Akt通路后HTR8/Svneo以及HUVECs生物学功能在H/R处理的调控情况,探讨ACK1基因对HTR8/Svneo以及HUVECs的生物学功能调控,在此基础上分析在子痫前期发病当中的机制和作用。研究分析结果:1.IHC的结果显示,ACK1在人类早孕期绒毛及蜕膜中存在表达,其基本定位细胞滋养细胞和合体滋养细胞;在蜕膜中,ACK1蛋白基本上在蜕膜细胞以及EVTs当中表达。在人类晚期足月产胎盘和子痫前期胎盘中也有表达,但其在后者的表达明显低于前者。2.在对HTR8/Svneo和HUVECs转染ACK1 sh RNA进行ACK1蛋白的下调后,两种细胞的生物学功能均受到影响,但两者的增殖和凋亡功能无明显改变。3.转染ACK1 sh RNA后,WB结果显示HTR8/Svneo细胞和HUVECs中MMP2和MMP9的表达均下降,而TIMP1/2的表达上升。4.在HTR8/Svneo细胞和HUVECs中,当ACK1的表达下调后,前者的迁移和侵袭能力明显下降,而后者的迁移和管腔形成能力较正常组下调;5.当细胞处于缺氧/复氧状态时,HUVECs以及HTR8/Svneo细胞的生物学功能减弱,同时,ACK1蛋白的表达减低。同时,给予H/R处理后,可下调两种细胞细胞中Akt的磷酸化活化水平,同时,下游因子表达发生相应的改变。实验结论:第一,ACK1基因调控妊娠期血管内皮细胞和滋养细胞的生物学功能。第二,在ACK1的表达下调的情况下,能够使得滋养细胞的迁移以及侵袭能力受到抑制,内皮细胞管腔形成与迁移等生物学功能降低。第三,ACK1基因通过调控Akt磷酸化来调控滋养细胞及内皮细胞的生物学功能,并且受氧化应激的影响,但其不影响PI3K的表达,其表达的下调可能对子痫前期的发生发展过程具有促进作用。


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