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TLR4-Peli1轴介导的神经炎症在小鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用及机制

黄学平  
【摘要】:背景:蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是临床常见的脑血管危急重症,占据了所有卒中的5%左右。SAH患者具有致死率高、致残率高的特点,因而,SAH的治疗干预仍然是神经科医师面临的重大挑战。早期脑损伤(EBI)是指蛛网膜下腔出血开始至72小时这一时间窗的脑损伤。近来研究认为EBI可能是SAH后致死致残的主要原因。EBI涉及一系列病理生理过程,包括脑灌注压下降、血脑屏障破坏、脑肿胀和神经元凋亡等。大量研究表明,SAH后EBI和神经炎症密切相关。小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞,其活化可以诱导炎症细胞因子的释放。因此,抑制小胶质细胞活化、减少神经炎症成为治疗蛛网膜下腔出血有前景的策略。Toll样受体4(TLR4)是发现最早的TLRs亚型之一,其介导的炎症调节信号通路在SAH后早期脑损伤中发挥重要作用。尤其是,TLR4在小胶质细胞的表达上调介导了SAH后小胶质细胞活化,激活了炎症信号通路,促进神经元细胞凋亡。TLR4通过依赖My D88途径激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,从而诱导炎症因子合成。这些研究提示,TLR4信号通路是治疗蛛网膜下腔出血的一个有效的靶点。Peli1是一E3泛素化连接酶,在中枢神经系统的小胶质细胞大量表达。Peli1激活后,可介导TLR4诱导的炎症因子在小胶质细胞合成。Peli1通过细胞凋亡抑制蛋白(c IAP)的K63泛素化,介导My D88依赖的MAPK信号通路激活。这些研究提示了Peli1在神经炎症调节中的潜在作用。目的:探讨Peli1在实验性蛛网膜下腔出血早期脑损伤中的作用,同时研究Peli1与TLR4信号通路对早期脑损伤中小胶质细胞活化和神经炎症的调节机制及两者相互作用关系。方法:第一部分1、通过颈内动脉线栓刺破法建立C57小鼠蛛网膜下腔出血模型,通过Western blot和免疫荧光检测Peli1蛋白在小鼠脑组织和小胶质细胞株BV2中的时空性表达。2、通过Western blot检测SAH后6 h、24 h、48 h和72 h不同时间点TLR4、c IAP1/2以及MAPK家族蛋白(p-JNK和p-ERK)的表达。第二部分1、构建Peli1慢病毒干扰载体,转染BV2细胞后,通过q RT-PCR检测Peli1基因并验证其干扰效率。2、经C57小鼠侧脑室注射Peli1慢病毒干扰载体上清和无义序列慢病毒上清,将小鼠随机分为假手术组(Sham)、蛛网膜下腔出血+无义序列组(SAH+Peli1-NC)和蛛网膜下腔出血+干扰组(SAH+Peli1-KD),通过Garcia评分检测SAH造模后48小时三组间神经功能缺陷程度,通过MRI扫描检测脑组织水肿情况,通过Western blot检测TLR4、My D88、c IAP1/2、凋亡相关蛋白(Bcl2和Bax)、MAPK家族蛋白(p-JNK和p-ERK)以及i NOS蛋白的表达,通过ELISA检测炎性细胞因子IL-6的表达。第三部分1、通过免疫荧光观察SAH后TLR4和小胶质细胞标记IBA1的表达情况;2、C57小鼠尾静脉注射TLR4抑制剂TAK242;C57小鼠被随机分为假手术组(Sham组)、蛛网膜下腔出血+溶剂对照组(SAH+vehicle组)和蛛网膜下腔出血+TAK242组(SAH+TAK242组),通过Garcia评分检测SAH造模后48小时三组间神经功能缺陷程度,通过Western blot检测三组间TLR4、My D88、i NOS、Peli1、c IAP1/2以及凋亡相关蛋白(Bcl2和Bax)、MAPK家族蛋白(p-JNK和p-ERK)的表达。结果:第一部分1、在实验性蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中,Peli1蛋白表达呈时间依赖性增高。2、Peli1蛋白主要在小胶质细胞表达,在神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞表达较低。3、蛛网膜下腔出血后,c IAP1/2、TLR4、p-ERK和p-JNK蛋白表达增加,Peli1的表达趋势与炎症调节相关蛋白的表达趋势相关。4、蛛网膜下腔出血后,i NOS蛋白表达增加,并且Peli1和CD16/32共表达于小胶质细胞。第二部分1、Peli1重组慢病毒干扰载体转染BV2细胞后,荧光定量PCR结果显示,以Peli1-KD2干扰效率最高。2、经侧脑室注射Peli1慢病毒干扰载体预处理后,蛛网膜下腔出血后48 h,Peli1蛋白表达显著降低。3、Peli1的下调,提高了蛛网膜下腔出血后Garcia评分,减轻了脑水肿。4、蛛网膜下腔出血后48 h,Western blot结果显示,Peli1下调后,Bax蛋白表达降低,Bcl2蛋白表达增加。并且,Peli1下调导致p-JNK和p-ERK蛋白表达降低。此外,ELISA结果显示,Peli1下调导致蛛网膜下腔出血后48 h细胞因子IL-6水平下降。5、蛛网膜下腔出血后48 h,Western blot结果显示,Peli1下调后,i NOS蛋白表达降低。6、蛛网膜下腔出血后48 h,Western blot结果显示,Peli1下调后,c IAP1/2和K48蛋白表达降低,但TLR4和My D88蛋白表达无明显改变。第三部分1、免疫荧光染色结果显示,蛛网膜下腔出血后48 h,TLR4和IBA1共表达于小胶质细胞。2、蛛网膜下腔出血后48 h,TLR4抑制剂TAK242提高了Garcia评分。3、蛛网膜下腔出血后48 h,Western blot结果显示,TAK242处理抑制了TLR4和My D88蛋白水平,并降低了p-JNK和p-ERK蛋白表达水平。4、蛛网膜下腔出血后48 h,Western blot结果显示,TAK242处理后,Bax蛋白表达降低,Bcl2蛋白表达增加。5、蛛网膜下腔出血后48 h,Western blot结果显示,TAK242治疗降低了i NOS蛋白表达,但对Peli1和c IAP1/2蛋白表达无明显影响。结论:第一部分1、小鼠蛛网膜下腔出血后,Peli1表达增加,并且和炎症调节通路相关蛋白(c IAP1/2、TLR4、p-ERK和p-JNK)相关,提示Peli1可能参与蛛网膜下腔出血后炎症调节。2、小鼠蛛网膜下腔出血后,Peli1主要在小胶质细胞表达,并且和M1型小胶质细胞活化密切相关。第二部分1、下调Peli1表达能够显著减少小鼠蛛网膜下腔出血后炎症因子合成,抑制M1型小胶质细胞活化,抑制细胞凋亡,减轻脑水肿,改善神经功能缺陷,在早期脑损伤中发挥神经保护作用。2、实验性蛛网膜下腔出血后Peli1主要通过介导c IAP1/2蛋白表达增加,从而激活My D88依赖的MAPK信号通路,诱导炎症因子合成。第三部分1、TLR4信号通路在蛛网膜下腔出血后依赖My D88途径激活MAPK信号通路,从而介导M1型小胶质细胞活化。2、TAK242通过作用于TLR4信号通路,抑制MAPK信号通路,阻止M1型小胶质细胞活化,并抑制细胞凋亡,发挥对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的神经保护作用。


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