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基因芯片技术探究肺炎克雷伯菌RcsAB的转录谱

苏克文  
【摘要】:目的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)是临床上重要的条件致病菌,主要引起肺炎、泌尿系统疾病、肝脓肿以及菌血症等临床疾病。Rcs磷酸信号转导系统是细菌中重要的双分子信号转导系统,可调控菌体众多毒力基因的表达。本文运用基因芯片技术探究肺炎克雷伯菌RcsAB的转录谱,在全基因组范围内筛选RcsA、RcsB、RcsAB调控的靶基因,并随机选取部分靶基因,运用RT-qPCR技术对芯片的数据结果进行验证。通过对靶基因的生物信息学分析及其调控机制的探究来进一步深入了解RcsAB对肺炎克雷伯菌毒力的影响。方法首先,利用同源重组技术从肺炎克雷伯菌NTUH-K2044中敲除rcsA及rcs B基因,获得突变株Kp-ΔrcsA、Kp-ΔrcsB、Kp-ΔrcsAB。其次,提取野生株和3株突变株的RNA并进行纯化。然后,对提取的RNA进行逆转录合成cDNA,并进行荧光标记。接着,标记好的cDNA与芯片上的探针进行杂交及扫描。通过扫描得到的原始数据进行归一化处理和分析后得到差异表达基因。之后,运用实时荧光定量PCR技术和LacZ报告基因融合实验验证基因芯片的结果。最后,通过对差异表达基因的COG分析和GO富集分析,得到差异表达基因的基因功能及其调控机制。结果1、基因芯片技术共筛选得到43个受RcsA调控的靶基因,其中表达上调的基因有16个,表达下调的基因有27个;223个受RcsB调控的靶基因,其中表达上调的有91个,表达下调的有132个;以及210个受RcsAB调控的靶基因,其中表达上调基因83个,表达下调基因127个。2、运用RT-q PCR技术对随机挑选的14个差异表达基因的芯片结果进行验证,经过比对分析,两个实验结果的一致性为92.86%,表明芯片结果具有较高的可信度。3、LacZ报告基因融合实验进一步确证fadJ的转录水平,LacZ结果显示与RT-qPCR结果相一致。4、COG分析得知RcsA调控的靶基因主要是参与无机离子的转运和代谢,碳的转运和代谢,脂类的转运和代谢以及参与细胞壁/膜的合成过程等相关基因;RcsB调控的主要是参与能量的产生和代谢,碳的转运和代谢以及参与细胞壁/膜的合成等过程的基因;Rcs AB调控的主要是参与碳的转运和代谢以及蛋白质转录等过程的基因。5、GO富集分析得到RcsA调控的靶基因主要参与催化活性,辅因子结合,单一体形成等生理生化相关过程;RcsB调控的靶基因主要参与胞质内部的酶的催化活性,碳水化合物衍生物代谢,外膜合成等生理生化过程;RcsAB调控的靶基因主要参与羧酸、含氧酸等有机酸的代谢过程以及小分子分解等生理生化过程。结论本研究运用基因芯片技术筛选得到受RcsA、RcsB以及RcsAB调控的靶基因,并通过实时荧光定量PCR技术及LacZ报告基因融合技术验证芯片结果。COG分析及GO富集分析明确了靶基因参与的细胞功能,为研究肺炎克雷伯菌的毒力机制提供了相关数据并奠定了基础。后续可对筛选得到的差异基因有针对性的进行表型实验分析,进一步深入了解Rcs磷酸信号转导系统对肺炎克雷伯菌毒力的影响,为临床上防治肺炎克雷伯菌引起的感染提供相应的理论依据。


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