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肺炎克雷伯菌KP1_2626基因参与菌株毒力的初步研究

张仲双  
【摘要】:目的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)是引起社区获得性感染和医院院内感染的重要条件致病菌之一。KP1_2626基因编码的蛋白属于LuxR家族的调控蛋白,LuxR家族转录调控子可以通过调控相关基因从而控制着细菌毒力、生物膜形成等。为探讨KP1_2626基因对菌株毒力的影响,本研究通过构建KP1_2626基因缺失的突变株Kp-?2626及其回补株Kpc-?2626,与野生株NTUH-K2044对比,分析突变株Kp-?2626和回补株Kpc-?2626毒力表型的差别,为进一步研究KP1_2626基因对菌株毒力的调控机制提供理论依据。方法通过同源重组敲除KP1_2626基因片段得到突变株Kp-?2626,然后,将含有KP1_2626基因片段的重组质粒转化入突变株中得到回补株Kpc-?2626。测定NTUH-K2044、Kp-?2626和Kpc-?2626的生长曲线,了解KP1_2626基因对细菌生长的影响。随后,通过结晶紫实验和拉丝实验来比较三株菌株生物膜生成情况和菌株超粘性。最后,用NTUH-K2044、Kp-?2626和Kpc-?2626三种菌株感染A549细胞,通过检测细胞乳酸脱氢酶LDH释放量来反应细菌对细胞的毒性。结果1.突变株Kp-?2626和回补株Kpc-?2626构建成功。2.Kp-?2626和Kpc-?2626与野生株NTUH-K2044的生长曲线走势相近,无明显差异,表明KP1_2626基因的缺失对菌株生长无影响。3.三株菌株分别培养12小时、24小时和36小时后,生物膜测定的结果均为突变株Kp-?2626的生物膜形成能力减弱,回补株Kpc-?2626处于野生株NTUH-K2044和突变株Kp-?2626生物膜水平之间。4.拉丝实验结果表明突变株Kp-?2626无明显拉丝现象,超粘性与野生株相比减弱。5.细菌以MOI=1 000作为最佳感染复数感染细胞21小时,测定反应液上清中乳酸脱氢酶(LDH)的含量。野生株NTUH-K2044的细胞毒性(81.8%)明显高于突变株Kp-?2626的细胞毒性(6.1%),回补株Kpc-?2626的细胞毒性(68.19%)介于野生株和突变株之间。结论KP1_2626基因的缺失不影响细菌的生长。敲除KP1_2626基因后,细菌的超粘性、生物膜生成量和细胞毒性明显降低,提示该基因可能正向影响细菌的毒力。


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