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细粒棘球绦虫的6种水通道蛋白基因研究

吴宏烨  
【摘要】:目的1、建立适合细粒棘球绦虫原头蚴在体外形成棘球蚴的培养体系,为研究原头蚴囊化过程提供实验材料。2、检测细粒棘球绦虫6种水通道蛋白(EgAQPs)基因在体外培养的囊化原头蚴和小鼠体内的继发棘球蚴生发层细胞的动态转录表达量,分析EgAQPs基因的表达状态与棘球蚴囊液形成的关系。3、克隆细粒棘球绦虫的6种水通道蛋白基因,使用非洲爪蟾卵母细胞异源表达Eg AQPs蛋白,以检测其通透水的功能,为阐明棘球蚴囊液的形成过程提供理论依据。方法1、以RPMI1640或DMEM培养基为基质、胎牛血清或绵羊血清为营养成分、人肝细胞株L02为饲养细胞设计配伍2大类、共10个组培养体系,培养细粒棘球绦虫原头蚴45 d,根据各组原头蚴的头节外翻率、成囊率和囊泡大小情况,寻找适合原头蚴形成棘球蚴的体外培养体系最佳配伍;在最佳配伍的培养体系中继续培养观察棘球蚴囊泡至180 d。2、收集不同时期在体外培养的囊化原头蚴和小鼠体内的继发棘球蚴标本,设计特异性引物,获得6种EgAQPs基因的目的片段,采用实时荧光定量PCR的方法,检测Eg AQPs基因在体外培养的囊化原头蚴和小鼠体内的继发棘球蚴生发层细胞中转录表达量。3、根据GenBank上细粒棘球绦虫的6种AQPs基因序列,以细粒棘球蚴cDNA为模板,应用RT-PCR方法扩增EgAQP和Eg AQP1两个基因的编码区片段;应用化学合成的方法扩增4种Eg AQPs(EgAQP4-1、EgAQP9-2、EgAQPAnG、EgAQP FA-CHIP)基因编码区片段;并在非洲爪蟾卵母细胞中表达这6种EgAQPs蛋白,验证其水通道功能。结果1、在体外培养的前45 d,DMEM体系的G组(DMEM+胎牛血清+人肝细胞株L02)培养的棘球蚴的生长最快,20 d起原头蚴成囊率高于其他各组(P0.05),25 d起棘球蚴囊泡大于其他各组(P0.05),第45 d时原头蚴成囊率达到100%;在其后的时间(45-180 d)内,棘球蚴囊泡持续增大,至第80 d时肉眼可见透明棘球蚴囊泡,至180 d时最大囊泡直径达2.2 mm。2、形态学观察发现不论是体外培养的囊化棘球蚴,还是继发感染小鼠动物模型体内的棘球蚴,棘球蚴的体积均随着培养时间的延长而逐渐增大,囊内透明液体增多;Eg AQP9-1基因在体外培养的原头蚴起始日转录表达量最高(P0.01),第10 d时转录表达量迅速下降(P0.01),且随着培养时间的延长呈下降趋势,其差异有统计学意义(P0.05);Eg AQP、Eg AQP AnG、EgAQP1、Eg AQP FA-CHIP、EgAQP4-1、EgAQP9-2基因在体外培养不同时间的原头蚴和棘球蚴生发层细胞中转录表达水平均很低,基本上检测不到。3、注射了6种EgAQPs基因(EgAQP、EgAQPAnG、EgAQP1、EgAQP FA-CHIP、EgAQP4-1、EgAQP9-2)cRNA的卵母细胞与对照组(注射DEPC水)的卵母细胞的体积变化率(V/V_0)差别无统计学意义(P0.05),透水系数差别有统计学意义(P0.05);Western blotting结果显示注射这6种EgAQPs cRNA的非洲爪蟾卵母细胞总蛋白、胞质蛋白和胞膜蛋白均不能被Anti-Flag标签抗体识别,这6种EgAQPs在非洲爪蟾卵母细胞中未表现出水通道蛋白的功能。结论1、添加胎牛血清及人肝细胞株L02的DMEM培养基有利于体外培养的原头蚴发育为棘球蚴囊泡。2、EgAQP9-1在原头蚴囊化后可能对棘球蚴囊液生成的影响降低;EgAQP、EgAQP AnG、EgAQP1、EgAQP FA-CHIP、EgAQP4-1、EgAQP9-2基因可能与棘球蚴囊液生成的关系很小。3、细粒棘球绦虫基因组中存在编码AQPs的基因,但在本研究中通过基因克隆、转录表达分析及卵母细胞功能验证的6种EgAQPs未见到水通道蛋白的功能,说明此6种EgAQPs在非洲爪蟾卵母细胞里不表达,或存在微量的表达,且通过Western blotting检测未见有通透水的功能,进一步证实这6种基因在棘球蚴囊液形成或积累中所起的作用甚小。


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