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探究人BMSCs通过共培养对人瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的影响

薛碧宇  
【摘要】:研究背景瘢痕疙瘩为结缔组织过度增生和透明变形而引起的良性皮肤病变。目前瘢痕疙瘩形成原因尚未明确,虽然临床上有多种治疗瘢痕疙瘩的方法,但均各有利弊,且单一方法疗效差,复发率高,不能令医生及患者满意。有研究发现KFs中存在DNA甲基化现象,DNMT1表达明显增高,表明DNMT1在瘢痕疙瘩生长过程中起重要的作用。且发现通过DNMT1的抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可以调节KFs中TGF-β/Smad这一重要的信号通路,使KFs中TGF-β1、Coll-Ⅰ蛋白质表达下降,抑制型Smad7蛋白表达回升。间充质干细胞在预防和治疗皮肤瘢痕的领域已取得较好成效,且有研究发现人骨髓间充质干细胞(BMSCs)条件培养基抑制KFs的增殖、迁移,抑制KFs中TGF-β的分泌及胶原的合成,但产生影响的具体机制尚不明确。我们发现骨髓间充质干细胞培养液及DNMT1的抑制剂均可使瘢痕疙瘩成纤维细胞中TGF-β1的表达降低,故我们猜想BMSCs是否通过抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞DNA的甲基化而对TGF-β/Smad信号通路产生影响,进而影响KFs的增殖及细胞外基质的合成。本实验通过Transwell小室构建间接细胞共培养体系,并比较共培养体系和非共培养体系中成纤维细胞内DNA甲基转移酶1,TGF-β/Smad信号通路相关因子及金属基质蛋白酶2的表达,探究骨髓间充质干细胞产生抗瘢痕作用的部分机制。第一部分人骨髓间充质干细胞,人正常皮肤成纤维细胞,人瘢痕疙瘩成纤维细胞的培养和鉴定及共培养体系的建立目的:通过培养BMSCs和成纤维细胞,构建人骨髓间充质干细胞与成纤维细胞的间接共培养体系,探究人骨髓间充质干细胞微环境对成纤维细胞的作用。方法:1)用HE染色和免疫细胞化学方法对人瘢痕疙瘩成纤维细胞,人正常皮肤成纤维细胞进行鉴定。2)用流式细胞仪对人骨髓间充质干细胞进行鉴定(CD29+,CD44+,CD45-);3)用Transwell小室构建人骨髓间充质干细胞与成纤维细胞的间接共培养体系,并观察共培养后成纤维细胞形态学上的变化。结果:1)HE染色显示细胞NHDFs细胞为多角形或长梭形,KFs细胞多为长梭形,免疫细胞化学染色显示细胞波形蛋白表达呈阳性,表现为抗原定位处为棕黄色。NHDFs细胞排列较为规则,呈放射状或螺旋状。KFs细胞排列紊乱,失去极性。2)BMSCs呈长梭形、成纤维细胞样,表达CD90、CD44,不表达CD34;3)用Transwell小室成功建立人BMSCs与成纤维细胞间接共培养体系,共培养48h倒置显微镜下观察可见,KFs细胞数目明显少于正常组,形态由长梭形变短,细胞排列局部呈漩涡状。结论:用Transwell小室可以构建人BMSCs与成纤维细胞间接共培养体系,且骨髓间充质干细胞通过旁分泌可对瘢痕疙瘩成纤维细胞的形态产生影响。第二部分人骨髓间充质干细胞微环境对人瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的影响目的:研究骨髓间充质干细胞旁分泌因子所构成的微环境对人瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的影响方法:取第3代成纤维细胞随机分为4组:KF组,KF共培养组,NHDF组,NHDF共培养组,培养48h后使用免疫荧光和激光共聚焦技术,Western blot和q PCR检测各组细胞内DNMT1的表达情况。结果:DNMT1蛋白主要在细胞核内表达,在KFs中呈高表达,在NHDFs中呈低表达,共培养组KFs较非共培养组DNMT1的蛋白和m RNA水平表达明显降低(P=0.000)。共培养组NHDFs较非共培养组DNMT1的蛋白和m RNA水平表达无明显差异。结论:共培养48h,共培养组人瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的表达明显降低,说明骨髓间充质干细胞通过旁分泌作用可以抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的表达。第三部分人骨髓间充质干细胞微环境对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β/Smad信号通路的影响目的:探究人BMSCs影响KFs中DNMT1的表达后,是否对KFs中TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达产生影响方法:取第3代成纤维细胞随机分为4组:KF组,KF共培养组,NHDF组,NHDF共培养组,培养48h后,使用Western blot各组细胞内P-smad2、P-smad3、TGF-β1,MMP2的蛋白表达情况,q PCR检测各组细胞内抑制性蛋白Smad7在m RNA水平的表达情况。结果:共培养组KFs较非共培养组中TGF-β1、P-smad2、P-smad3,MMP2在蛋白水平表达显著降低(P=0.000),抑制性蛋白Smad7在m RNA水平表达增高(P=0.002),而NHDFs在共培养前后表达无明显差异。结论:BMSCs通过旁分泌作用使得TGF-β1,P-smad2,P-smad3表达减少,smad7表达增多,同时抑制MMP2的表达,说明BMSCs通过旁分泌作用可以调控TGF-β/Smad信号通路,使KFs细胞外基质合成减少。


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