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LASS2基因在肝脂质代谢中的作用及机制研究

杨艳  
【摘要】:目的:探索LASS2在肥胖、肝脂肪变性模型中的表达变化,初步了解LASS2与肝脂质代谢的关系。方法:采用实时荧光定量PCR法、Western blot法分别检测雄性C57BL/6J小鼠、ob/ob小鼠、db/db小鼠、KK-Ay小鼠和APOE~(-/-)小鼠肝组织中LASS2 m RNA和蛋白的表达水平,其中C57BL/6J小鼠随机分为普食组和高脂组(均从6周龄开始喂养普食或高脂16周)。FFAs诱导小鼠原代肝细胞、Hepa1-6肝癌细胞脂肪变性,定量PCR法、Western blot法分别检测各组细胞LASS2 m RNA和蛋白的表达水平。结果:与C57BL/6J小鼠比较,ob/ob小鼠、db/db小鼠、KK-Ay小鼠和APOE~(-/-)小鼠肝组织中LASS2的m RNA和蛋白表达水平均显著降低(P0.01);C57BL/6J高脂喂养组小鼠肝组织中LASS2的蛋白表达水平较普食组明显下调(P0.01),但其m RNA表达水平未见明显差异(P0.05);与原代肝细胞和Hepa1-6肝癌细胞非FFAs诱导组相比,FFAs诱导组肝细胞LASS2蛋白表达水平也显著降低(P0.01),m RNA表达水平也未见明显差异(P0.05)。结论:LASS2可能与脂质代谢、肝脂肪变性的发生发展有关。目的:探讨LASS2对高脂诱导的NAFLD小鼠肝脂质代谢及相关通路基因的影响。方法:将健康雄性C57BL/6J小鼠随机分为普食组(CHD)、高脂组(HFD)组,喂养16周后HFD组尾静脉分别注射AAV-TBG(肝组织特异性启动子)LASS2重组表达载体,即分为过表达对照组(HFD-GFP)、LASS2过表达组(HFD-m LASS2)、敲低对照组(HFD-sh GFP)、LASS2敲低组(HFD-shm LASS2)并记录每周体重变化。AAV注射4周后,分别行IGTT、血脂、ALT、AST等血清生化指标检测,肝脏组织切片行HE染色病理学分析,酶法检测肝组织TG、TC含量。RT-q PCR、Western blot法分别检测肝组织中LASS2、脂肪酸合成相关基因(FAS、SREBP1)、脂质分解相关基因(ATGL)、胆固醇合成相关基因(SREBP2、HMGCR)、脂肪酸β氧化相关基因(CPT1A)的变化。结果:与HFD-GFP或HFD-sh GFP组比较,HFD-m LASS2组或HFD-shm LASS2组小鼠肝组织中LASS2 m RNA和蛋白表达水平明显上调或下调(均P0.01),提示体内过表达或敲低LASS2的模型构建成功。与CHD组比较,HFD组小鼠体重、肝重均明显增加,HE染色显示HFD组小鼠肝组织明显脂肪变性;HFD-m LASS2组小鼠体重、肝重均较HFD-GFP组明显减轻(P0.05),肝脏脂肪变性相对减轻。HFD组小鼠空腹血糖均较CHD组明显增高(P0.05),且葡萄糖耐量受损、血清生化指标(ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C)均明显升高(P0.05);与HFD-GFP组比较,HFD-m LASS2组小鼠腹膜糖耐量受损明显改善,且血清生化指标、肝组织TG或TC含量均明显降低(P0.05)。HFD-m LASS2组FAS、SREBP1、SREBP2、HMGCR m RNA和蛋白表达水平均明显降低(均P0.01),ATGL、CPT1A m RNA和蛋白表达水平均明显增加(均P0.01)。上述实验均在HFD-shm LASS2组观察到与HFD-m LASS2组相反的结果。结论:LASS2通过调控肝脏脂肪酸合成、脂质分解、胆固醇合成及脂肪酸β氧化相关基因改善脂代谢紊乱,在NAFLD进程中过表达LASS2具有保护性作用,反之奕然。目的:探讨LASS2对FFAs诱导的肝细胞脂质积累及脂代谢通路相关基因的影响。方法:应用Adv-h LASS2-GFP感染Hep G2肝癌细胞48h后,激光共聚焦显微镜观察LASS2-GFP融合蛋白亚细胞定位。分离培养原代小鼠肝细胞(MPHs)、Hepa1-6肝癌细胞,FFAs诱导肝细胞脂肪变性,LASS2过表达(Adv-m LASS2-GFP)和敲低(Adv-shm LASS2-GFP)腺病毒分别感染肝细胞,油红O染色观察脂质积累的变化,并微量法生化检测分析肝细胞内TG的含量。RT-q PCR、Western blot法分别检测MPHs、Hepa1-6细胞或Hep G2细胞中LASS2、脂肪酸合成相关基因(FAS、SREBP1、ACC)、脂质分解相关基因(ATGL、HSL)、胆固醇合成相关基因(SREBP2、HMGCR)、脂肪酸β氧化相关基因(PPARα、CPT1A)的变化。结果:激光共聚焦显微镜观察结果显示LASS2主要分布在核膜,少量分布在胞浆。与NC组、LOC(Adv-GFP)组或Lsh C(Adv-sh GFP)组比较,LO(Adv-m LASS2或Adv-h LASS2)和Lsh(Adv-shm LASS2)组肝细胞中LASS2 m RNA和蛋白表达水平明显上调或下调(P0.001),提示体外过表达或敲低模型构建成功。在MPHs和Hepa1-6细胞中,油红O结果显示,与NC、LOC组比较,LASS2过表达明显改善FFAs诱导的肝细胞脂质积累,且胞内TG含量明显减少(均P0.01)。此外,LO组FAS、SREBP1、SREBP2、HMGCR m RNA和蛋白表达水平均明显下调(均P0.01);t-ACC、HSL蛋白表达水平未见明显差异(P0.05),p-ACC/t-ACC比值、p-HSL/HSL比值、ATGL、CPT1A、PPARαm RNA和蛋白表达水平明显上调(均P0.05)。在Hep G2中过表达LASS2对上述基因表达的作用,其结果与之一致。在上述实验中,MPHs、Hepa1-6细胞中LASS2敲低则观察到与过表达组相反的结果。结论:从体外再次验证了LASS2通过调控脂肪酸合成、脂质分解、胆固醇合成及脂肪酸β氧化相关基因的表达,改善FFAs诱导的肝细胞脂质积累。目的:探讨LASS2调控肝脂质代谢的相关分子机制。方法:Adv-GFP或Adv-m LASS2感染FFAs或非FFAs诱导的Hepa1-6肝细胞,CO-IP/LC-MS鉴定与LASS2互作蛋白复合物,通过GO、KOGs、Pathway数据库对所有蛋白进行注释分析并富集确认关键蛋白,Co-IP Western blot初步验证LASS2与关键蛋白NDUFS2是否存在相互作用。重组构建LASS2、NDUFS2真核表达载体,并共转染FFAs或非FFAs诱导的Hepa1-6肝细胞,激光共聚焦显微镜观察LASS2与NDUFS2是否共定位。p EGFP-m LASS2、pm Cherry-Flag-m NDUFS2分别转染FFAs诱导的Hepa1-6细胞,Western blot法确认LASS2与NDUFS2的相互影响的作用。Adv-GFP、Adv-m LASS2感染原代肝细胞、Hepa1-6肝细胞,检测LASS2与NDUFS2/OXPHOS相互作用的级联信号通路(mt ROS/AMPK/m TORC1)进一步验证两者之间存在的互作关系。流式细胞术、激光共聚焦显微镜观察各组活细胞mt ROS的表达水平,透射电镜观察自噬/脂噬,Western blot法检测AMPK、Raptor、自噬相关蛋白(LC3I/II、p62、Beclin-1、Atg3/5/7)表达水平。结果:根据CO-IP/LC-MS鉴定结果及GO、KOGs、Pathway、STRING等分析,拟定NDUFS2/OXPHOS为待验证的与LASS2互作的关键蛋白。Co-IP western blot结果显示LASS2与NDUFS2存在相互作用。激光共聚焦显微镜观察结果显示LASS2与NDUFS2存在共定位。Western blot结果显示LASS2过表达下调了NDUFS2的蛋白表达水平(P0.01),但过表达NDUFS2,LASS2的蛋白表达水平未见明显变化(P0.05)。与对照组相比,LASS2过表达的MPHs、Hepa1-6肝细胞mt ROS水平明显增高(均P0.01);LASS2过表达增加了磷酸化的AMPKα、LC3Ⅱ/LC3I比值、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7蛋白表达水平(均P0.01),降低了磷酸化的Raptor、p62蛋白表达水平(均P0.01)。在上述实验中LASS2敲低则观察到与过表达组相反的结果。透射电镜观察结果显示,与对照组比较,FFAs诱导的Hepa1-6肝细胞LASS2过表达组可见较多的自噬溶酶体、自噬小体、脂噬小体。结论:LASS2可能通过与NDUFS2/OXPHOS互作介导mt ROS的生成,调控AMPK/Raptor/自噬(脂噬)级联信号通路,对FFAs诱导的肝细胞脂肪变性起保护作用,这也可能是LASS2调控肝脂质代谢的可能机制之一。


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