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结核分枝杆菌Cas1和RNA结合蛋白在结核致病及免疫逃逸中的作用

魏家玮  
【摘要】:研究背景:结核是由结核分枝杆菌引起的一种严重的传染性疾病,至今为止它仍然是全球十大致死原因之一,同样也是单一传染源导致的感染性疾病中最主要的死因。目前结核治疗中面临的两大最主要困难是治疗过程中的结核耐药和结核免疫逃逸,正是这两大因素导致结核治疗困难、化疗程长且容易复发。我们通过研究结核分枝杆菌CRISPR-Cas系统中一个关键蛋白Cas1和结核感染过程中诱导机体产生的RNA结合蛋白,探讨结核治疗中耐药发生的机制及逃避机体初级免疫的机制。研究方法:1.我们通过收集来自重庆医科大学附属第一医院初次确诊肺结核,且痰培养阳性的临床分类结核样本,通过PCR检测其Cas1基因及其侧翼序列的缺失情况。2.利用分枝杆菌噬菌体D29感染BCG构建共感染模型,利用高通量测序技术检测BCG受到分枝杆菌噬菌体D29感染后的CRISPR插入序列的变化情况,研究CRISPR-Cas在分枝杆菌噬菌体抵抗中的作用。3.构建分枝杆菌穿梭质粒在M.smegmatis中异源性表达结核分枝杆菌Cas1蛋白。4.通过H_2O_2,SDS和酸化培养基模拟环境压力条件,分别计算重组M.smegmatis在不同压力条件下生存率的变化情况,研究结核分枝杆菌Cas1蛋白对环境压力应激的影响。5.利用刃天青微量滴定法,研究Cas1蛋白对重组M.smegmatis抗生素敏感性的影响。6.利用体外表达纯化的结核分枝杆菌RpfE,通过计算复苏指数RI,研究Cas1蛋白对抗生素压力下的重组M.smegmatis滞留状态的影响。7.分别利用DNA损伤剂顺铂和丝裂霉素C诱导重组M.smegmatis产生DNA损伤,研究Cas1蛋白对重组M.smegmatis DNA损伤修复的影响。8.通过转录组测序,分析Cas1蛋白影响重组M.smegmatis DNA损伤修复可能的分子机制。9.利用体外表达纯化的结核分枝杆菌Cas1蛋白,与来源于结核分枝杆菌CRISPR插入序列的300bp双链DNA和CRISPR间隔序列来源62bp的双链DNA相互作用,研究其DNA结合活性和DNA酶切活性。10.通过Zfp36+/-和Zfp36 flox/flox转基因鼠杂交,得到髓系细胞选择性Zfp36基因敲除的转基因鼠。11.使用Mtb/BCG感染小鼠骨髓巨噬细胞,通过WB和qt-PCR研究结核感染如何诱导RNA结合蛋白TTP在巨噬细胞中表达。12.利用髓系细胞选择性Zfp36基因敲除的小鼠巨噬细胞,并以BCG为替代模型,感染小鼠巨噬细胞,通过qt-PCR研究TTP对感染巨噬细胞细胞因子谱产生的影响。13.分别利用氢-3标记的尿嘧啶掺入BCG生长抑制试验和BCG侵染巨噬细胞菌落形成单位测定,研究TTP对巨噬细胞抑菌作用和杀菌作用的影响。14.利用Zfp36基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞,利用血清剥夺和雷帕霉素诱导自噬,通过WB检测微管相关蛋白轻链3,免疫荧光染色探测细胞内自噬小体的形成,研究TTP对自噬过程的影响。15.分别使用MAPK抑制剂SB203580,mTOR通路阻断剂雷帕霉素、AZD8055和PP242研究mTOR通路对TTP转录和表达的影响。并进一步利用λ蛋白磷酸酶去除TTP的磷酸化修饰,研究mTOR通路对TTP磷酸化修饰的影响。16.通过利用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺阻断蛋白合成,研究mTOR通路对TTP蛋白稳定性的影响。17.通过利用蛋白酶体抑制剂MG132阻断泛素-蛋白酶通路介导的蛋白降解作用,研究mTOR-泛素-蛋白酶体通路在调节TTP蛋白稳定性中起到的作用。18.通过免疫共沉淀法研究TTP蛋白的泛素化修饰作用。研究结果:1.35株临床分离的结核分枝杆菌样本中,20例(57.14%)出现Cas1基因的缺失及其侧翼序列的改变。2.分枝杆菌噬菌体D29并不能完全杀灭体外培养的BCG,侵染30天后对BCG的CRISPR序列高通量测序,插入序列中检测不到与D29基因组相匹配的序列。3.通过转染分枝杆菌穿梭质粒,结核分枝杆菌的Cas1蛋白能够在重组M.smegmatis中异源性表达。4.表达Cas1的重组M.smegmatis的形态和生长情况发生变化,表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照菌落形态更加光滑及湿润,并且在液体培养基中也更容易聚集成团,电镜下表面皱劈更少。表达Cas1蛋白的重组M.smegmatis相对于空载体对照生长更缓慢,达平台期时间更长,但是达到平台期以后的OD_(600)值更高,平台期的细菌密度更大。5.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照在H_2O_2,SDS和酸化培养基模拟的环境压力下生存率更低。6.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照对利福平、乙胺丁醇和左氧氟沙星的敏感性提高,但对链霉素敏感性影响不大。7.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照在半致死剂量的利福平、乙胺丁醇和左氧氟沙星抗生素压力下,进入滞留状态的细菌更少。8.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载对照对顺铂和丝裂霉素C诱导产生的DNA损伤更加敏感。9.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载对照其DNA损伤修复相关基因表达明显下调,其中包括主要RuvAB复合物、重组蛋白F、核酸内切酶IV、ATP依赖的DNA螺旋酶、尿嘧啶DNA糖苷酶、重组酶A、重组调节蛋白RecX、DNA修复ATP酶、DNA修复外切酶、烷基化DNA修复蛋白、DNA修复蛋白RadA、DNA完整性扫描蛋白DisA、核酸内切酶Ⅲ和DNA聚合酶IV。10.重组结核分枝杆菌Cas1蛋白体外表现出金属离子依赖的DNA酶活性。11.通过Zfp36+/-和Zfp36 flox/flox转基因鼠杂交,能使TTP在小鼠巨噬细胞中选择性敲除。12.Mtb和BCG感染均可诱导小鼠巨噬细胞产生TTP,选择性删除TTP蛋白的巨噬细胞受到感染后能产生更多促炎细胞因子,巨噬细胞杀菌作用增强,BCG在巨噬细胞内生长被抑制。13.TTP能够抑制小鼠胚胎纤维细胞在血清剥夺诱导下的自噬发生,但对雷帕霉素诱导的自噬效果不明显。14.BCG感染能够激活小鼠巨噬细胞mTOR通路,MAPK抑制剂SB203580和mTOR通路抑制剂雷帕霉素、AZD8055以及PP242能够抑制BCG感染引起的巨噬细胞TTP表达。15.mTOR通路抑制剂能加速TTP在巨噬细胞内降解。蛋白酶体抑制剂MG132能阻断mTOR抑制导致的TTP降解。16.mTOR通路是通过泛素化-蛋白酶体依赖途径来调节TTP的细胞内降解,mTOR通路抑制剂雷帕霉素能加速TTP的泛素化从而促进其蛋白酶体途径的降解。研究结论:1.分枝杆菌对其噬菌体的抗性可能并不主要依赖于CRISPR-Cas系统介导的插入序列而获得的。2.Cas1的丢失对结核分枝杆菌的环境压力抵抗、DNA修复以及抗生素耐药可能产生广泛的影响,这可能是不含Cas1基因的结核杆菌北京家系在特定地区高流行的原因。3.Mtb/BCG感染巨噬细胞后能诱导细胞产生RNA结合蛋白TTP,从而抑制感染巨噬细胞的杀菌作用,达到逃避初级免疫杀灭的目的。4.TTP的稳定性受到mTOR-泛素化-蛋白酶体通路的调节,mTOR抑制剂通过促进TTP泛素化从而加速其蛋白酶体途径的降解,增强巨噬细胞的杀菌作用。


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