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miR-29c-3p通过DNMT3B参与Hippo信号通路调控肝癌恶性生物学行为的机制研究

邬昊  
【摘要】:目的:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌(primary liver carcinoma,PLC)的重要组成部分,也是临床上最常见的恶性肿瘤之一,每年造成788000人死亡[1]。同时,肝细胞肝癌也是我国肿瘤死亡的主要原因,患者就诊时多为中晚期,并伴有肝内、外转移,预后较差[2]。肿瘤的复发与转移仍是导致肝细胞肝癌治疗失败的主要原因,给家庭及社会造成沉重负担。重要的是,肝细胞肝癌的发生发展是一个涉及多个信号通路的复杂病理生理过程。因此,迫切需要找到肝细胞肝癌发生发展的关键分子靶点及信号通路,为防控肝细胞肝癌提供精准的方向,并改善肝细胞肝癌患者的生存质量。Micro RNA(miRNA)是一类长度为20-24nt的单链非编码小RNA,以序列特异性方式结合靶基因的m RNA转录物,导致相应m RNA的降解或翻译抑制,并调控靶基因的表达[3]。最新研究表明,在多种疾病中均能发现miRNAs表达异常,这些表达异常的miRNAs被认为与肿瘤的恶性发生发展有关[4]。大量的科学研究表明,miR-29c-3p作为miRNAs重要成员在肿瘤的发生发展中扮演了重要的角色。然而,miR-29c-3p在肝细胞肝癌中的表达与作用还尚不明确,其通过哪些信号通路参与了肝细胞肝癌的的恶性生物学行为还不得而知。在本研究中,我们将分析miR-29c-3p在肝细胞肝癌中的表达及与患者临床病理特征和预后之间的联系,研究miR-29c-3p及其靶基因在肝细胞肝癌恶性生物学行为中的作用,进一步找到miR-29c-3p通过具体的信号通路调控肝细胞肝癌的恶性生物学行为的分子机制。本研究将为肝细胞肝癌的精准诊断与治疗提供一定的科学理论依据。方法:1.通过荧光定量PCR与miRNA原位杂交方法检测miR-29c-3p在肝细胞肝癌肿瘤组织和配对癌旁组织中的表达水平。利用Kaplan-Meier生存分析、单因素和多因素Logistic回归分析miR-29c-3p的表达水平与肝细胞肝癌患者不良预后之间的联系。荧光定量PCR检测miR-29c-3p在不同肝癌细胞系中的表达水平。2.采用人工合成pre-miR-29c-3p和miR-29c-3p inhibitor干扰miR-29c-3p的表达水平。采用Ed U增殖,细胞克隆和CCK8实验检测干扰miR-29c-3p表达后对Hep G2与MHCC-97H细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验检测干扰miR-29c-3p表达后对Hep G2与MHCC-97H细胞迁移能力的影响。采用甲基化特异性PCR与亚硫酸氢盐测序法检测干扰miR-29c-3p表达后对Hep G2与MHCC-97H细胞中LATS1基因DNA甲基化水平的影响。构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察在干扰miR-29c-3p对Hep G2与MHCC-97H细胞在裸鼠皮下移植瘤生长的影响。3.使用生物信息学在线网站寻找并验证miR-29c-3p的下游靶基因。荧光素酶标记实验验证miR-29c-3p与下游靶基因DNMT3B的结合作用。采用Ed U增殖,细胞克隆和CCK8实验检测在过表达miR-29c-3p的细胞中过表达DNMT3B对Hep G2与MHCC-97H细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验检测在过表达miR-29c-3p的细胞中过表达DNMT3B对Hep G2与MHCC-97H细胞迁移能力的影响。采用甲基化特异性PCR检测在过表达miR-29c-3p的细胞中过表达DNMT3B对Hep G2与MHCC-97H细胞中LATS1基因DNA甲基化水平的影响。采用western blot检测在过表达miR-29c-3p的细胞中过表达DNMT3B对Hippo信号通路表达的影响。结果:1.miR-29c-3p在77.6%的肝细胞肝癌肿瘤组织中存在低表达的情况,而miR-29c-3p在68.9%的配对癌旁组织中存在高表达的情况,统计学分析表明miR-29c-3p在肝细胞肝癌肿瘤组织中的表达水平明显低于配对癌旁组织(P0.05)。统计学分析发现miR-29c-3p的表达与肿瘤大小(P=0.018)、肿瘤个数(P=0.011)和肝内转移(P=0.035)密切相关。miR-29c-3p低表达的肝细胞肝癌患者术后总体生存时间显著缩短,低表达miR-29c-3p是肝细胞肝癌患者预后较差的独立危险因素。2.荧光定量PCR结果显示在肝癌细胞系SMMC-7721、Huh-7、MHCC-97H和Hep G2细胞中miR-29c-3p表达水平显著低于LO2;其中MHCC-97H表达水平最低。CCK8细胞增殖实验、Edu摄取实验与克隆形成实验结果提示有效提高miR-29c-3p的表达后肝癌细胞的细胞增殖能力、Edu摄取能力与细胞克隆形成率均显著低于对照组,统计学分析表明提高miR-29c-3p的表达能够显著抑制Hep G2与MHCC-97H细胞的增殖能力。细胞划痕实验结果提示有效提高miR-29c-3p的表达后肝癌细胞的细胞划痕宽度显著大于对照组,统计学分析表明提高miR-29c-3p的表达能够显著抑制Hep G2与MHCC-97H细胞的迁移能力。动物模型结果提示有效提高miR-29c-3p的表达后肝癌细胞在裸鼠皮下移植瘤的形成与生长水平显著低于对照组,统计学分析表明提高miR-29c-3p的表达能够显著抑制Hep G2与MHCC-97H细胞的裸鼠皮下移植瘤的形成与生长。WB结果显示有效提高miR-29c-3p表达后LATS1,p-YAPs127,BAX的表达水平显著高于对照组,而YAP,BCL-2,KI-67的表达水平显著低于对照组,统计学分析表明提高miR-29c-3p的表达能够显著促进Hep G2与MHCC-97H细胞中Hippo信号通路的表达。3.生物信息学在线网站与荧光素酶标记实验证实DNMT3B为miR-29c-3p的有效靶基因。甲基化特异性PCR结果提示有效提高miR-29c-3p表达后LATS1基因的DNA甲基化水平显著降低,并且过表达DNMT3B后LATS1基因的DNA甲基化水平显著得到恢复与提高,统计学分析表明过表达DNMT3B能够部分逆转由过表达miR-29c-3p对Hep G2与MHCC-97H细胞中LATS1基因DNA甲基化水平的抑制作用。CCK8细胞增殖实验、Edu摄取实验与克隆形成实验结果提示在过表达miR-29c-3p的肝癌细胞中有效提高DNMT3B的表达后肝癌细胞的细胞增殖能力、Edu摄取能力与细胞克隆形成率均显著高于对照组,统计学分析表明过表达DNMT3B能够部分逆转由过表达miR-29c-3p对Hep G2与MHCC-97H细胞增殖能力的抑制。细胞划痕实验结果提示在过表达miR-29c-3p的肝癌细胞中有效提高DNMT3B的表达后肝癌细胞的细胞划痕宽度显著低于对照组,统计学分析表明过表达DNMT3B能够部分逆转由过表达miR-29c-3p对Hep G2与MHCC-97H细胞迁移能力的抑制。WB结果显示在过表达miR-29c-3p的肝癌细胞中有效提高DNMT3B的表达后YAP,BCL-2,KI-67的表达水平显著高于对照组,LATS1,p-YAPs127,BAX的表达水平显著低于对照组,统计学分析表明过表达DNMT3B能够部分逆转由过表达miR-29c-3p对Hep G2与MHCC-97H细胞中Hippo信号通路表达的促进作用。免疫组化结果提示DNMT3B在肝细胞肝癌肿瘤组织中的表达水平显著高于配对癌旁组织,预后统计学分析表明高表达DNMT3B的肝癌患者预后较差(P0.05)。免疫组化结果提示LATS1在肝细胞肝癌肿瘤组织中的表达水平显著低于配对癌旁组织,预后统计学分析表明低表达LATS1的肝癌患者预后较差(P0.05)。结论:1.miR-29c-3p在肝癌患者中的低表达与肝细胞肝癌患者预后呈显著相关性,是肝细胞肝癌患者预后的独立危险因素。2.miR-29c-3p通过DNMT3B调控LATS1基因的DNA甲基化水平及其蛋白表达水平。3.miR-29c-3p通过DNMT3B影响LATS1的表达并参与Hippo信号通路对肝细胞肝癌恶性生物学行为的调控。


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