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miR-211-5p通过下调COX2的表达改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤

彭哲  
【摘要】:第一部分mi R-211-5p对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑损伤的影响目的:筛选出在局灶性脑缺血再灌注(MCAO/R)大鼠脑中有明显表达变化的mi RNAs;观察mi R-211-5p与COX2在MCAO/R大鼠皮层和海马再灌注时间不同情况下的表达变化,并分析其相关性;通过给予mi R-211-5pagomir和antagomir进行干预观察其对MCAO/R大鼠脑损伤的影响,以及对COX2及其下游产物、相关炎症因子的影响。方法:1.生物信息学初筛mi RNAs在本研究中,我们希望找到靶向COX2内源性表达的mi RNAs以抑制炎症。我们使用靶标预测数据库(Target Scan,mi RBase和mi Randa)评估哪些mi RNAs能靶向COX2基因。在三个数据库中均能被检索到的mi RNA用于缺血再灌注损伤大鼠脑组织表达检测,以确定后续观察研究采用的mi RNA。2.MCAO/R大鼠脑卒中模型建立雄性8周龄SD大鼠,用1%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔麻醉,于右侧颈总动脉插入尼龙栓线(L3600,广州佳灵)至大脑中动脉起始段(栓线插入深度约18mm),阻塞右侧大脑中动脉血流90min,拔出栓线并缝合切口。再灌注时间的选择,根据不同部分实验需要可分别为6h、12h、24h、48h、72h。动物给药均在造模前24小时进行侧脑室注射。3.实验分组(1)实验动物共分为三个批次。为了筛选出有明显表达差异的mi RNAs,第一批分为三个组:正常组(normal)、假手术组(sham)、再灌注24小时组(24h)、n=3。(2)为了观察mi R-211-5p与COX2在再灌注时间不同情况下的表达变化,SD大鼠分为六个组:假手术组、再灌注6小时组(6h)、再灌注12小时组(12h)、再灌注24小时组(24h)、再灌注48小时组(48h)、再灌注72小时组(72h),n=3。(3)为了观察mi R-211-5p干预观察对MCAO/R大鼠脑损伤的影响,SD大鼠共分为六个组:假手术组、MCAO/R+溶剂组、MCAO/R+mi R-211-5p agomir组、MCAO/R+agomir阴性对照(nagetive control,NC)组、MCAO/R+antagomir组、MCAO/R+antagomir NC组,n=10。造模前一天给予mi R-211-5p相关的试剂侧脑室注射。3.主要观察方法及指标通过彩色激光多普勒血流仪在造模时检测其血流的变化;通过神经功能缺损评分0-5分法评价其变化;通过TTC染色检查脑梗死情况,并计算梗死面积;采用HE染色,观察海马及皮层病理学改变;采用免疫荧光观察COX2在神经元中的变化;ELISA法检测大鼠海马及皮层中PGD_2、PGE2、TNF-α、IL-1β的含量;q-PCR检测mi R-211-5p和COX2 m RNA的变化;Western blot检测COX2蛋白表达。结果:1.与正常组相比,假手术组无明显差异;与假手术组相比,再灌注24小时组大鼠皮层mi R-211-5p明显下调,海马mi R-211-5p明显上调。2.随着再灌注时长的不同,mi R-211-5p在皮层呈现先降低后上升的趋势,在12小时达到谷值;mi R-211-5p在PC12细胞中也呈现先升高后降低的趋势,在48小时达峰值。COX2在皮层及海马均为先上升后降低的趋势。3.与假手术组相比,MCAO/R+溶剂组大鼠神经功能缺损评分明显升高,脑梗死面积显著增大,皮层及海马空泡现象、核深染和固缩现象明显增多;皮层及海马COX2 m RNA和蛋白的表达均明显上升,皮层及海马PGD_2、PGE2、IL-1β、TNF-α含量明显升高;与MCAO/R+假手术组相比,MCAO/R+mi R-211-5p agomir组大鼠神经功能缺损评分明显降低,脑梗死面积显著减小,皮层及海马空泡现象、核深染和固缩现象明显减少;皮层及海马COX2 m RNA和蛋白的表达均明显下降,皮层PGE2、IL-1β、TNF-α含量以及海马PGD_2、IL-1β、TNF-α含量明显减少。与溶剂组相比,MCAO/R+mi R-211-5p antagomir组大鼠神经功能缺损评分明显增加,脑梗死面积显著增大,皮层及海马空泡现象、核深染和固缩现象明显增多;皮层及海马COX2 m RNA和蛋白的表达均明显上升,皮层PGE2、IL-1β、TNF-α含量明显升高,海马PGD_2、IL-1β、TNF-α含量明显升高。与MCAO/R+溶剂组相比,MCAO/R+agomir NC组与MCAO/R+antagomir NC组均无明显差异。结论:1.mi R-211-5p在MCAO/R处理的大鼠皮层及血浆表达明显降低,而在海马表达明显增加。2.mi R-211-5p与COX2 m RNA的表达呈负相关。3.mi R-211-5p对CIRI有神经保护作用,其机制可能与抑制COX2表达,进而降低下游产物及炎症因子水平有关。第二部分mi R-211-5p对氧糖剥夺处理致PC12细胞损伤的影响目的:观察mi R-211-5p对氧糖剥夺处理致PC12细胞损伤的影响,从COX2内源性表达调控探讨其机制。方法:1.OGD/R致PC12细胞损伤模型建立PC12细胞在无糖DMEM培养基,95%N2、5%CO2的三气培养箱中37℃培养2h,然后将细胞培养基换为正常培养基并转移至含95%空气和5%CO2的普通培养箱中37℃培养复氧24小时(OGD/R)2.实验分组(1)为了观察mi R-211-5p与COX2在体外的时间依赖性表达,第一批细胞分为六个组:正常组、OGD/R 0h组、OGD/R 3h组、OGD/R 6h组、OGD/R 12h组、OGD/R 24h组、OGD/R 72h组。(2)为了观察mi R-211-5p对OGD/R致PC12细胞损伤的影响并分析其可能存在的机制,第二批细胞分为六个组:正常组、OGD/R组、OGD/R+mi R-211-5p mimic组、OGD/R+mimic阴性对照(nagetive control,NC)组、OGD/R+inhibitor组、OGD/R+inhibitor NC组。(3)为了探究mi R-211-5p的作用是否会被COX2 si RNA逆转,第三批细胞分为四个组:正常组、OGD/R组、OGD/R+mi R-211-5p inhibitor组、OGD/R+mi R-211-5p inhibitor+COX2 si RNA组。3.主要观察方法及指标:MTT法及LDH法检测细胞增殖与存活情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;q-PCR检测mi R-211-5p和COX2 m RNA的变化;Western blot检测COX2蛋白表达;ELISA法检测PC12细胞PGD_2、PGE2的含量;双荧光素酶报告基因法检测COX2 m RNA上是否有mi R-211-5p的结合位点。结果:1.与正常对照组相比,OGD/R组细胞凋亡率、LDH释放率明显上升,增殖率明显下降,COX2 m RNA及蛋白表达明显上升,PGD_2、PGE2的含量明显上升。与OGD/R组相比,mi R-211-5p mimic组细胞凋亡率、LDH释放率明显下降,增殖率明显上升,COX2 m RNA及蛋白表达明显下降,PGD_2、PGE2的含量明显下降;与OGD/R组相比,mi R-211-5p inhibitor组细胞凋亡率、LDH释放率明显上升,增殖率明显下降,COX2 m RNA及蛋白表达明显上升,PGD_2、PGE2的含量明显上升;与OGD/R组相比,mimic NC组与inhibitor NC组无明显差异。2.与mi R-211-5p inhibitor组相比,mi R-211-5p inhibitor+COX2 si RNA组细胞LDH释放率明显下降,增殖率明显上升,COX2 m RNA及蛋白表达明显下降。3.双荧光素酶报告基因法证实COX2 m RNA的非编码区有mi R-211-5p的结合位点。结论:1.mi R-211-5p mimic对OGD/R致PC12细胞损伤具有保护作用,并且降低了COX2及其下游产物的表达;mi R-211-5p inhibitor对OGD/R致PC12细胞损伤具有加重作用,并且升高了COX2及其下游产物的表达;表明mi R-211-5p可能通过调控COX2参与OGD/R损伤。2.双萤光素酶实验证实COX2的非编码区存在mi R-211-5p的结合位点,并且COX2 si RNA可以显著地逆转mi R-211-5p inhibitor的作用。进一步说明mi R-211-5p是通过内源性靶向抑制COX2表达,进而发挥对OGD/R致PC12细胞损伤的保护作用


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