骨细胞Notch信号调控骨稳态的研究

【摘要】：目的:本研究利用小鼠Cre-LoxP技术,在骨细胞中特异性激活Notch信号通路关键调控分子Notch1-NICD,探究骨细胞Notch信号对小鼠骨稳态的调控作用,为研发骨靶向抗骨松药物提供理论依据。方法:1、通过将Notch1-NICD~(flox/flox)基因修饰小鼠(Rosa26启动子和NICD编码序列之间存在一个两侧有LoxP修饰位点的终止盒)与DMP1-8kb-Cre工具鼠(骨细胞表达Cre重组酶)杂交,基因型鉴定出突变鼠(daNICD~(Ot))和同窝对照鼠(ctrl)。2、对出生第一天的乳鼠骨骼进行茜素红染色,分析小鼠胚胎时期的长骨发育状况。3、连续监测小鼠的生长发育情况,计算生存率。4、利用X线骨密度仪检测一月龄小鼠的骨密度变化。5、对小鼠胫骨进行HE染色和TRAP染色,静态骨组织形态学分析一月龄小鼠的松质骨骨量变化,成骨、破骨细胞数量变化等。6、qPCR检测小鼠胫骨骨组织Notch信号靶基因Hes1、Hes5、Hes7、Hey1、Hey2、HeyL;成骨标志基因Alp、Runx2、Osx、Ocn;破骨标志基因Rank L/Opg、M-CSF、cathepsin K、calcitonin receptor、RANK;Wnt信号靶基因Bmp4、Smad6、Lef1、Axin2、Cyclin D1。7、ELISA检测小鼠血清学P1NP和CTX的循环水平。结果:1、基因型鉴定出DMP1-Cre~(+/-);Notch1-NICD~(fl/+)小鼠(daNICD~(Ot))为激活骨细胞Notch1-NICD的突变鼠,DMP1-Cre~(-/-);Notch1-NICD~(fl/+)小鼠(ctrl)为对照鼠。2、乳鼠骨骼茜素红染色显示,激活骨细胞Notch1-NICD的突变鼠在胚胎时期长骨生长发育正常,与对照鼠无明显差异。3、激活骨细胞Notch1-NICD的突变鼠出现严重的生长发育障碍,小鼠早死,至35天时小鼠存活率为零。4、X-Ray结果显示,daNICD~(Ot)突变鼠的骨密度显著降低(P0.05)。5、静态骨组织形态学分析结果显示,daNICD~(Ot)突变鼠松质骨骨量降低,成骨细胞数量减少,破骨细胞数量增加,皮质骨孔隙率增加(P0.05)。6、qPCR结果显示,daNICD~(Ot)突变鼠骨组织中Notch信号靶基因(Hes1、Hey1、HeyL)表达增高(P0.05);成骨标志基因(Alp、Runx2、Osx、Ocn)表达降低(P0.05);破骨标志基因(M-CSF、cathepsin K、RANK)表达增高,Rank L/Opg比值增高(P0.05);Wnt信号靶基因(Bmp4、Smad6、Lef1、Axin2)表达降低(P0.05)。7、ELISA结果显示血清学P1NP水平降低,CTX水平增加(P0.05)。结论:激活骨细胞Notch信号减少成骨细胞、降低成骨分化;增加破骨细胞、增强骨吸收。