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肿瘤型OATP1B3对上皮性卵巢癌侵袭迁移的影响及其分子机制研究

郑玉洁  
【摘要】:目的:肿瘤型OATP1B3(Cancer-type organic anion transporting polypeptide 1B3,Ct-OATP1B3)是新近发现的摄入型药物转运体肝脏型OATP1B3的剪接异构体,在多种恶性肿瘤中存在高表达,但其生物学功能及作用机制却远未阐明。本研究旨在探索Ct-OATP1B3在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)中的表达及功能,试图为EOC寻找新的生物标志物及干预靶点。方法:(1)免疫组化法检测Ct-OATP1B3在EOC患者肿瘤组织中的表达水平,分析Ct-OATP1B3的表达与EOC患者临床分期及预后之间的关系。(2)q RT-PCR法检测Ct-OATP1B3在人EOC细胞株SKOV3、OVCAR3、A2780、HEY2和人正常卵巢上皮细胞株HOSE中的表达。(3)选取EOC细胞株OVCAR3和A2780,采用细胞膜蛋白与细胞浆蛋白分离及细胞免疫荧光法检测Ct-OATP1B3在EOC细胞株中的定位。(4)构建Ct-OATP1B3过表达和敲低稳定转染细胞模型,采用CCK-8、流式细胞仪、细胞划痕实验、以及Transwell小室实验等方法分析Ct-OATP1B3对EOC细胞生长增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。(5)用免疫共沉淀及质谱分析法检测EOC细胞株中Ct-OATP1B3的结合蛋白,寻找其下游靶点,探索Ct-OATP1B3促进EOC侵袭迁移的分子机制。(6)利用免疫共沉淀及邻位连接技术(proximity ligation assay,PLA)验证EOC细胞株中Ct-OATP1B3与胰岛素样生长因子2 m RNA结合蛋白2(insulin-like growth factor 2 m RNA-binding protein 2,IGF2BP2)之间的相互结合(7)免疫组化法检测IGF2BP2在EOC患者肿瘤组织中的表达水平,分析IGF2BP2的表达与EOC患者临床分期及预后之间的关系,并分析EOC组织中Ct-OATP1B3与IGF2BP2表达水平的相关性。(8)利用q RT-PCR、化学交联及Western blotting法观察Ct-OATP1B3对IGF2BP2表达量及蛋白同源二聚体形成的影响。(9)利用基因通路富集分析法(gene sets enrichment analysis,GSEA)分析TCGA数据库中Ct-OATP1B3富集的分子通路,用RNA-免疫沉淀法观察EOC细胞株中Ct-OATP1B3对IGF2BP2蛋白与其下游靶m RNA——肉碱棕榈酰酰转移酶1A(carnitine palmitoyl transferase 1A,CPT1A)及NADH∶泛素氧化酶A2亚基(NADH∶ubiquinone oxidoreductase subunit A2,NDUFA2)之间结合程度的影响。(10)采用q RT-PCR和Western blotting法观察EOC细胞株中Ct-OATP1B3通过IGF2BP2对CPT1A和NDUFA2 m RNA的稳定性及表达水平的影响。(11)采用~3H标记的同位素示踪法、NAD+/NADH检测法、线粒体呼吸链复合物Ⅰ检测法、ATP检测法及Seahorse能量代谢仪观察EOC细胞株中Ct-OATP1B3通过IGF2BP2对线粒体脂肪酸β氧化(fatty acidβoxidation,FAO)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)的影响。(12)采用免疫荧光法观察EOC细胞株中Ct-OATP1B3通过IGF2BP2对细胞侵袭性伪足形成的影响。(13)采用原位注射方式构建EOC细胞系来源的异体种植肿瘤(cell-derived xenograft,CDX)模型,通过生物发光系统观察不同时间节点下小鼠肿瘤生长情况,处死小鼠后观察并统计腹腔转移瘤个数、转移瘤重量、腹水体积;取肿瘤组织固定并进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色来观察肿瘤组织的恶性程度;免疫组化染色来观察Ct-OATP1B3、CPT1A和NDUFA2的表达变化;透射电镜分析肿瘤组织中线粒体嵴的数量、长度和宽度变化。结果:(1)本研究共纳入25例人正常卵巢上皮组织,127例EOC患者组织标本。免疫组化结果显示,Ct-OATP1B3在人正常卵巢上皮组织中无表达;而在妇产科医师联合会(Federation of Gynecologists and Obstetricians,FIGO)分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期EOC组织中,Ct-OATP1B3的表达显著上调,且分期越晚,Ct-OATP1B3的表达水平越高。在这127名EOC患者中,Ct-OATP1B3高表达患者的总体生存期和无进展生存期明显低于Ct-OATP1B3低表达患者(P0.001)。TCGA数据库分析结果同样表明,EOC患者临床分期越晚,Ct-OATP1B3表达水平越高,患者的总体生存期越短(P0.05)。(2)q RT-PCR结果显示,Ct-OATP1B3 m RNA在正常卵巢上皮细胞HOSE中表达量极低,而在EOC细胞SKOV3、OVCAR3、A2780、HEY2中其表达水平明显增高。(3)细胞膜与细胞浆蛋白分离和细胞免疫荧光结果显示,Ct-OATP1B3蛋白主要分布于OVCAR3和A2780的细胞质内。(4)q RT-PCR及Western blotting结果显示,A2780细胞经过表达质粒转染后,Ct-OATP1B3 m RNA和蛋白水平分别为空载组的130.2倍和3.8倍(P0.01);相反,OVCAR3细胞经敲低质粒转染后,Ct-OATP1B3 m RNA和蛋白水平相较于阴性对照组分别下降了75.0%和37.2%(P0.01)。生物学功能实验表明,Ct-OATP1B3可显著提高EOC细胞的侵袭迁移能力:与空载组相比,A2780细胞过表达Ct-OATP1B3后侵袭迁移能力增强(P0.01);而OVCAR3细胞敲低Ct-OATP1B3后,细胞的侵袭迁移能力减弱(P0.01)。此外,Ct-OATP1B3对EOC细胞的生长增殖能力影响较弱,对细胞凋亡率则无显著影响。(5)免疫共沉淀及质谱分析结果表明,EOC细胞中有33个Ct-OATP1B3的潜在结合蛋白,其中IGF2BP2结合分数较高。(6)免疫共沉淀及PLA实验证明,在EOC细胞中Ct-OATP1B3与IGF2BP2蛋白之间存在直接相互结合。(7)免疫组化结果显示,IGF2BP2在人正常卵巢上皮组织中没有表达;而在FIGO分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期EOC组织中,IGF2BP2的表达水平显著上调。在这127名EOC患者中,IGF2BP2高表达患者的总体生存期和无进展生存期明显短于IGF2BP2低表达患者(P0.001)。在EOC病人中,Ct-OATP1B3与IGF2BP2的表达呈正相关性(P0.001)。(8)q RT-PCR、化学交联及Western blotting实验表明,在EOC细胞中Ct-OATP1B3对IGF2BP2的表达水平无明显影响,但可显著促进IGF2BP2蛋白同源二聚体形成。(9)对TCGA数据库的EOC样本进行GSEA分析,发现Ct-OATP1B3高表达的样本在OXPHOS通路有富集;RNA免疫共沉淀结果显示,在OVCAR3和A2780细胞中,Ct-OATP1B3可显著促进IGF2BP2蛋白与其下游靶基因CPT1A m RNA及NDUFA2 m RNA的结合。(10)在EOC细胞中,Ct-OATP1B3可显著增强CPT1A与NDUFA2的表达:与空载组相比,A2780细胞过表达Ct-OATP1B3后CPT1A、NDUFA2的m RNAs稳定性增加,蛋白水平上调(P0.01),IGF2BP2敲低可逆转此作用;而OVCAR3细胞敲低Ct-OATP1B3后,CPT1A、NDUFA2的m RNAs稳定性降低,蛋白水平下降(P0.01),IGF2BP2过表达可逆转此作用。(11)Ct-OATP1B3可通过IGF2BP2促进EOC细胞线粒体FAO和OXPHOS活性:相对于空载组,过表达Ct-OATP1B3后FAO明显上调(P0.01),NAD+/NADH增加(P0.01),线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性和ATP生成率增加(P0.05),敲低IGF2BP2后可逆转此作用;相比阴性对照组,敲低Ct-OATP1B3后细胞FAO明显下调(P0.01),NAD+/NADH减少(P0.01),线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性和ATP生成率均减少(P均0.01),过表达IGF2BP2后逆转此作用。Seahorse XFp检测细胞耗氧率结果显示,相对于空载组,过表达Ct-OATP1B3后,细胞的基础耗氧率.、最大耗氧率及ATP生成耗氧率均增加(P0.05),敲低IGF2BP2后可逆转此作用;相比阴性对照组,敲低Ct-OATP1B3后细胞的基础耗氧率、最大耗氧率及ATP生成耗氧率均减少(P0.01),再过表达IGF2BP2后可挽救此作用。(12)细胞免疫荧光结果显示Ct-OATP1B3通过IGF2BP2促进了A2780及OVCAR3细胞侵袭性伪足形成。(13)体内实验表明,Ct-OATP1B3促进EOC的转移:与空载组相比,过表达Ct-OATP1B3后CDX模型小鼠原位瘤荧光强度增强(P0.01),腹腔转移瘤数量、转移瘤重量及腹水体积均增加(P0.01),肿瘤组织HE染色显示肿瘤恶性程度较高,Ct-OATP1B3、CPT1A和NDUFA2免疫组化阳性率均上调(P0.01),线粒体嵴数目、长度和宽度均增加(P0.05);而敲低Ct-OATP1B3后产生相反的作用。结论:Ct-OATP1B3在EOC组织中呈高表达,并且与临床分期及预后有关。在EOC细胞中,Ct-OATP1B3可与m RNA结合蛋白IGF2BP2直接结合,促进其同源二聚体的形成,提高其结合下游CPT1A、NDUFA2m RNAs的能力,使CPT1A、NDUFA2表达水平升高;CPT1A、NDUFA2表达上调后,可显著提高细胞的线粒体FAO及OXPHOS活性,使细胞ATP生成增多,从而促进细胞边缘侵袭性伪足的形成,最终导致EOC细胞侵袭迁移能力增强。


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