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HBsAg与结核杆菌HSP70融合乙型肝炎DNA疫苗的基础研究

梁增伟  
【摘要】: 目的: 结核杆菌热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)具有载体分子效应和 免疫佐剂的生物学功能,将结核杆菌HSP70基因与乙肝病毒表面抗原(HBsAg) 基因融合,构建融合乙型肝炎DNA疫苗,并进一步研究融合乙肝DNA疫苗在小 鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫应答的效果,旨在通过基因融合技术提高乙肝 DNA疫苗的免疫效果,并为进一步探索乙肝治疗性疫苗和融合蛋白疫苗打基础。 方法: 1.HSP70真核表达质粒的构建和鉴定:用PCR的方法从结核杆菌标准株H_(37)Rv 基因组中扩增出HSP70基因,经A-T克隆入质粒pGEM-T vector,构建成重组 质粒pGEM-HSP70,经酶切鉴定和DNA序列测定证实目的基因无误后,亚克 隆到质粒pcDNA3.1(+),构建成真核表达质粒pcDNA3.1-HSP70。 2.HBsAg及其与热休克蛋白70融合表达质粒的构建和鉴定:用PCR方法和基因 克隆技术,构建成重组质粒pCI-S(含HBsAg主蛋白基因全序列)、重组质粒 pCI-HSP70(含HSP70基因全序列)、融合表达质粒拉pCI-S-HSP70(含HBsAg 主蛋白与热休克蛋白70融合基因,即HBsAg基因敲除终止密码后,将其C端 与HSP70基因的N端融合)和融合表达质粒pCI-S-HSP70C(含HBsAg主蛋 白基因与HSP70基因C端约780bp的融合基因),上述质粒分别用酶切和DNA 序列测定鉴定。 3.重组质粒pCI-S、pCI-S-HSP70、pCI-S-HSP70C和pCI-HSP70在真核细胞中的 重庆医科大学博士学位论文 表达:重组质粒用脂质体介导的方法转染HepGZ细胞和COSJ细胞,48小时 后,用RT-PCR检测目的基因mANA在转录水平的表达;用免疫细胞化学检测 HBsAg在HopGZ细胞中的表达:用ELISA的方法检测HBsAg在HepGZ细胞 和COS-7细胞培养上清和细胞裂解液中的含量。 ’.质粒 DNA兔疫 BALB/c小鼠:分 10组,分别注射^;pCIS 0()ti,B: PCI-S-HSP70 100ug,C: PCI-HSP70 100fig,D:PCI-S-HSP70C 100fig,E:PCI-S 5肋g十沁1-*SP7o 50Ug,F:p*1-s 50*g巾*1-}*S*7o 50*g,0:p*1-s 50吧 巾*1-**8P70C soUg,H:乙肝疫苗IUg,1:*1一10oUg,J:P8s 10*。免 疫4周后,用ELISA检测小鼠血清中抗-HBS水平。4天后,予相同剂量的质 粒DNA加强免疫一次,加强免疫4周后,处死小鼠,用ELISA检测小鼠血清 中抗-HBS水平:用乳酸脱氢酶释放法检测小鼠脾细胞HBSAg特异性CTL活性; 并于体外用HBSAg刺激小鼠脾细胞,用ELISA检测小鼠脾细胞IL工、IFN-Y 和IL叶的分泌水平。 结果: 1.重组质粒的鉴定:经酶切鉴定或DNA序列测定证实重组质粒pCI习巾CIHSP70、 pCI-S-HSP70和pCI-S-HSP70C构建正确。 2.重组质粒在真核细胞中的表达:()分别用重组质粒pCIS、pCI毛nSP70、 pCIS-HSP70C和pCI-HSP70转染HopGZ 细胞,48八时后,用RT-PCR检测细 胞总RNA中目的基因mRNA的表达,结果均为阳性,说明在转录水平有目的 基因表达。(2)分别用重组质粒吓I-S、pCI-S-HSP70、pCI-S-HSP70C和对照 质粒PCIHSP70、PCI1eo转染HepGZ细胞,48 ,J\时后,用免疫细胞化学的方 法检测HBSAg,结果发现重组质粒扯-S、pCI-S-HSP70、pCIS-HSP70C转染 的HepGZ细胞在胞浆和核周有大量棕褐色的阳性颗粒,细胞核为深褐色,说明 PCI-S、PCIS-HSP70和PCI-S-HSP70C在HepGZ 细胞中有相应的蛋白表达;质 粒 pCI-HSP70、pCI-neo转染的 HepGZ 细胞为阴性。(3)分别用重组质粒 pCIS、 pCI-S-HSP70、pCI-S-HSP70C和对照质粒pCI-HSP70、pCI-neo转染HepGZ 细 4 重庆医科大学博士学位论文 胞和COS-7细胞,48小时后,用ELISA检测细胞培养上清及细胞裂解液中 HBsAg,质粒pCIS在HopGZ细胞和COSJ细胞的培养上清及细胞裂解液中 均为阳性,而pCIS-HSP70和pCIS-HSP70C仅在细胞裂解液中检测到HBSAg 为阳性,细胞培养上清为阴性,说明S基因与HSP70或HSP70C基因融合之后, 表达的融合蛋白不分泌到胞外。对照质粒pCI羽SP70、pCI心eo转染的细胞培 养上清及细胞裂解液均为阴性。 3.质粒DNA免疫小鼠体液免疫检测结果:门)初次免疫4周后,PCI七、 pCI-S-HSP70、pCI、S-HSP70C、pCI-S+pCI-HSP70,pCI-S +pCI-S-HSP70、 pCIS+pCI-S-HSP70C和乙肝疫苗组小鼠均检测至抗-HBS阳性,而以 pCI-S和 乙肝疫苗组抗-HBs的滴度最高,P/N值分别为 10.88和 10.40,对照组 pCI-HSP70、pClllCO和PBS为阴性;(二)力强免疫4周后,pCI-S、pCI-S+ pCIS-HSP70和乙肝疫苗组小鼠抗-HBS滴度显著升高,PM值分别


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