成人MSC诱导分化为骨和软骨细胞及与胎儿MSC间差异表达基因的筛选

【摘要】： 大块骨缺损的修复及各种原因导致的骨折不愈合至今仍是骨外科 领域尚待解决的重大课题，组织工程这门新兴学科的兴起使骨损伤的 修复迈向了一个新的时代。组织工程中一个首要解决的关键问题是寻 找满足要求和易于操作的种子细胞。目前已发现成人骨髓存在间充质 干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC），它们是一群具有多向分化潜 能的均质性细胞，在特定的诱导条件下可分化为多种间充质组织细胞， 如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、肝细胞和神经细胞 等。在体外长期培养的过程中，MSC始终保持其多向分化潜能，且遗传 背景相当稳定，体内植入反应较弱，是一种理想的组织工程种子细胞。 然而，人体内骨髓中MSC的含量极其稀少，每1×10~5-1×10~6个单个核 细胞中大约有1个MSC，组织工程中对种子细胞的数量要求巨大，如此 微量的MSC难以满足组织工程的需要，因此体外纯化和扩增MSC就显 得尤为重要。在本次实验对MSC的分离纯化方法是基于Friedenstein 的经典方法进行的改进。具体的做法是从正常成人肋骨获得的骨髓细 胞，用密度为1.073的Percoll分离后接种在含MSC专用培养基 （Mesencult）的塑料培养瓶中，三天后用新鲜培养基对其进行全量换 液，以后每周换液两次。待MSCs生长达80％融合状态时，用胰酶进行消 化后按1：3的比列接种在三个塑料培养瓶中。在本次实验中成人间充 质干细胞共扩增了15代，最后获得7.5×10~(12)个MSC，扩增约1.36×10~7 博士学位论文 中文摘要 倍。 动物体内实验表明，用全骨髓移植到骨缺损处可观察到骨和软骨 的形成，但这种转化具有随机性，且转化效率比较低，因此对其进行 预分化处理就显得非常的重要。我们在进行定向诱导分化的同时比较 了不同扩增代数的间充质干细胞向骨和软骨细胞转化的能力。具体的 实验方法是在成骨诱导体系中，MSCS接种24 ，J’时后，加入诱导剂10－’ mol＊地塞米松、10us／。16－甘油磷酸钠（p－GP）和 50 u g加l的抗坏 血酸。在成软骨诱导培养体系中，间充质干细胞首先被低速离心成细 胞微团，然后加入特定的诱导培养基和诱导剂10叼加ITGF十3。在诱 导过程中动态观察细胞形态的改变和相应的生化和免疫学指标：I、11 型胶原纤维，碱性磷酸酶、钙沉积和酸性蛋白聚糖。通过以上指标证 实我们在体外己成功的诱导了MSCS分化为骨和软骨细胞，实验中发现 不同扩增代数的MSC依然保持了向骨和软骨细胞分化的潜能。这一研 究将为间充质干细胞的临床应用提供理论依据、技术方法和丰富的种 子细胞。 体外扩增MSC的实验中，我们观察到成人和胎儿MSCS的增殖潜能 具有明显的差异，另有文献报道胎儿MSC的分化潜能明显强于成人MSC， 而胚胎期特异表达的基因可能在MSC的增殖分化过程中扮演重要的角 色，对这些分子的发掘和研究将有助于提高我们对成人MSC增殖分化 的调控，有助于发现与MSC定向分化相关的特异基因，而针对这些特 异的基因进行调控将显著提高成人MSC定向分化的效率，因此，研究 成人和胎儿间MSC基因表达的差异就显得极其的重要。基于上述理由， 我们联合应用了抑制削减杂交和基因芯片技术筛选胎儿和成人MSC中 差异表达的基因。 4 博土学位论文 中文摘要 我们首先应用抑制消减杂交技术建立了胎儿MSC的CDNA消减文 库。该方法通过将连有不同接头的两种待检样品CDNA分别与过量的对 照样品CDNA进行杂交后，合并继续进行第H轮杂交，并且在杂交后利 用对应于接头的特异性引物进行两轮抑制性PCR，扩增的产物通常便是 同对照样品相比待检样品中差异（高）表达的基因。由于在杂交过程 中引入过量的对照样品CDNA而使高、低丰度CDNA水平趋于一致，即 均衡化＊ zation人 所以对于分离低丰度的差异表达基因十分 有效。在我们建立的胎儿CDNA消减文库中包括了890个克隆，最后通 过PCR检测获得了768个阳性克隆。通过SSH方法建立的消减CDNA文 库可以同其它高通量筛选技术联合，对文库中的片段进行高效筛选。 因此，我们采用了基因芯片技术对文库进行了高通量的筛选。本实验 通过PCR方法对消减文库中的阳性克隆进行扩增，并利用芯片制备系 统的机械手将扩增产物有序地点在处理过的载玻片上，制成基因芯片。 将该芯片与不同荧光素标记的胎儿和正常成人MSC单链CDNA进行杂 交，经不同严谨度洗片处理后，利用不同波长激光激发并读取各克隆 散射的荧光信号，计算机定量分析信号强度，确定每个dNA克隆在两 种组织中的相对表达水平，从而判断出在胎儿和正常成人MSC中差异 表达的CDNA克隆。通过判定胎儿和成人MSC两者杂交信号比值小于0．3 和大于3的为胎儿中差异表达的基因。在我们的结果分析中。胎儿MSC 中高表达的克隆共有300个。从300个高表达的克隆中随机挑选了85 个克隆进行序列分析，发现六个新基因片段，对其中克隆91号，尝试 采用silico c1One方法进行全长的拼接，最后获得