EGFR介导的c-erbB2反义显像诊断乳腺癌的实验研究

【摘要】： 目的：探讨受体介导的反义显像作为乳腺癌早期诊断新方法的可行性，使患者能够得到早期诊断、及时治疗，降低乳腺癌的死亡率。 方法：采用自行合成的双功能螯合剂-巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯；用临床最常用的、物理性能优良的~｛99m｝Tc标记乳腺癌的一个主要癌基因c-erbB2 mRNA的反义寡核苷酸；研究了标记产物的标记率、放射化学纯度、比活度、稳定性、血浆蛋白结合率、生物学分布、药代动力学特点、细胞的摄取率及返流比率、细胞的生长、癌蛋白的表达；对荷乳腺癌裸鼠进行显像。 人工合成的3条15碱基的单链寡核苷酸，反义序列为:5'-NH_2-FTCCATGGTGCTCAC-3'，正义序列为：5'-NH_2-QTGAGCACCATGGAG-3'，无义序列为5'-NH_2-FGCCTTATCCGTAGC -3'(F，Q分别代表硫代磷酸化的碱基C、G)。反义寡核苷酸与c-erbB2癌基因 mRNA互补，正义、无义寡核苷酸作为对照。用~｛99m｝Tc标记后，以0.25M/L乙酸铵(pH=5.2)作为洗脱液，将标记混合物通过SephadexG25柱层析进行分离纯化。根据SephadexG25柱层析纯化结果，绘制淋洗曲线，计算标记率，收集第一个放射峰，用纸层析测定标记产物的放射化学纯度；分析标记产物室温放置4h后或与人血清孵育4h后的稳定性，用抽滤法测定标记的EGF-~｛99m｝Tc-ON的比活度。用50ml培养瓶90个，每个接种2.0×10~5个 WP=7 细胞，移入二氧化碳孵箱培养2天。当细胞覆盖瓶壁50％-60％时，每个培养瓶分别转染2μg EGF-~｛99m｝Tc-ON或~｛99m｝Tc-ON，在20min、40min、60min、120min、180min时测定细胞的摄取率，18h后测定细胞的返流比率，并对三组的返流比率进行比较。采用96孔板，每孔接种5.0×103个细胞，培养48h后，分别将含0.5μCi、1.0μCi、2μCi、5μCi等不同浓度的三种EGF-~｛99m｝Tc-ON及0.2μg、0.4μg、0.8μg、1.6μgEGF-PL复合物转染癌细胞，每种浓度加入3个孔中，24h再加入四唑盐，处理后测定各孔的吸光度。用50ml培养瓶18个，每瓶接种5.0×10~5个癌细胞，培养48h后，每瓶分别转染EGF-~｛99m｝Tc-ASON或三种~｛99m｝Tc-ON 2μg，或6μg EGF-PL复合物，24h后，测c-erbB2癌蛋白的表达水平。用三氯乙酸沉淀法测定EGF-~｛99m｝Tc-ON与家兔血浆蛋白结合率。以家兔为实验对象，研究EGF-~｛99m｝Tc-ASON和~｛99m｝Tc-ASON的药代动力学，绘制其药代动力学曲线，用3P97软件拟合药代动力学曲线方程。以雌性BALB/c小鼠为实验对象，每只经尾静脉注入约3μCi的EGF-~｛99m｝Tc-ASON或~｛99m｝Tc-ASON后，分别在0.5h、1h、2h、4h、8h、24h测定肝、脾、肾、心、血、肺、胃、肠、骨、脑、肌肉等组织器官的放射性计数，研究EGF-~｛99m｝Tc-ASON和~｛99m｝Tc-ASON在正常小鼠体内的分布。SKBR-3乳腺癌细胞1.0×10~7个接种每只裸鼠，让癌细胞在裸鼠体内生长15天，待肿瘤直经约为1cm时，乳腺癌模型构建完毕。将EGF-~｛99m｝Tc-ASON和~｛99m｝Tc-ASON 3μCi/鼠经尾静脉注入体内，分别于0.5h、1h、2h、4h测定肝、脾、肾、心、血、肺、胃、肠、骨、脑、肌肉、肿瘤等组织器官的放射性计数，研究EGF-~｛99m｝Tc-ASON和~｛99m｝Tc-ASON在荷瘤裸鼠体内的分布。将EGF-~｛99m｝Tc-SON和 WP=8 EGF-~｛99m｝Tc-NON以相同的浓度和方式注入裸鼠体内，于2h时测定上述组织器官的放射性计数，并比较三种EGF-~｛99m｝Tc-ON之间的差异。将EGF-~｛99m｝Tc-ASON按0.1mCi/鼠经尾静脉注入体内，分别于注射后1h、2h、3h、4h用SPECT进行显像。 结果：寡核苷酸的标记率分别为：反义寡核苷酸70.6％，正义寡核苷酸67.2％，无义寡核苷酸69.3％；分离纯化后放射化学纯度分别是97.8％、96.2％、97.1％；比活度分别为1.41MBq/μg、1.26MBq/μg、1.53MBq/μg；三种寡核苷酸的标记率、放射化学纯度和比活度相比较均无显著性差异(P0.05)。EGF-~｛99m｝Tc-ON在室温放置4h，或与血清孵育4h后均相当稳定。血浆蛋白结合率分别为：反义寡核苷酸11.82％，正义寡核苷酸12.78％，无义寡核苷酸10.93％，三者之间无显著性差异(P0.05)。细胞摄取率在20min-120min内，随时间的延长而增加，EGF-~｛99m｝Tc-ON细胞摄取率明显高于~｛99m｝Tc-ON，有显著性差异(P0.05)，在每一时间点前者的摄取率均比后者高3倍以上。细胞返流比率为：反义寡核苷酸21.81％，正义寡核苷酸39.28％，无义寡核苷酸50.76％，反义寡核苷酸明显低于正义和无义寡核苷酸(P0.05)，但三者的返流比率都较高。MTT实验，吸光度值：EGF-~｛99m｝Tc-ASON＜~｛99m｝Tc-ASON＜其余各组，用流式细胞仪测定癌蛋白的表达水平，EGF-~｛99m｝Tc-ASON组荧光强度最低，表明其能有效抑制癌基因的表达，使癌蛋白的表达量下降，与其它各组(~｛99m｝Tc-ASON、EGF- ~｛99m｝Tc-SON、EGF-~｛99m｝Tc-NON、EGF-PL及空白对照组)相比，有显著性差异(P0.05)。EGF-~｛99m｝Tc-ASON和~｛99m｝Tc-ASON在体内的药代动力学符合二室模型，其曲线方程为： WP=9 EGF-~｛99m｝Tc-ASON(KBq)：C=47.24351e~｛-0.16598t｝+1.83133e~｛-0.00651t｝ ~｛99m｝Tc-ASON(KBq)：C=78.43123e~｛-0.32872t｝+2.068347e~｛-0.00728t｝ 正常BALB/c小鼠体内放射性分布以肝、肾为最高，肺、脾、