三氧化二砷（AS_2O_3）对人卵巢癌细胞株SKOV_3、3AO的作用及其机制的研究

【摘要】： 卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，五年存活率较低，徘徊在25-30%。因卵巢癌极易发生腹腔转移，直接影响患者的寿命及生存质量，因此，探索有效的腹腔内化疗具有重要的临床意义。80年代初，我国学者发现As_2O_3治疗复发的急性早幼粒细胞白血病（APL）达到很高的缓解率，从此，掀起了国内外对砷剂抗肿瘤研究的热潮。尽管砷剂对血液系统肿瘤有了较深入的研究，但在实体瘤方面的研究尚不多见，As_2O_3对人卵巢癌的作用目前尚未见相关报道。本课题应用光镜和电镜观察，MTT法，流式细胞术，免疫组织化学，逆转录PCR等技术，从As_2O_3对人卵巢癌细胞生长的影响，及诱导凋亡的作用机制等方面进行探讨，为As_2O_3在实体瘤的临床应用提供实验依据。主要结果与结论如下： 1．不同浓度（2~20umol/L）As_2O_3均可抑制SKOV_3、3AO细胞增殖，且具有剂量和时间依赖性，As_2O_3对3AO细胞增殖抑制作用比SKOV3减弱；光、电镜均观察到As_2O_3作用SKOV_3、3AO细胞72h后出现凋亡形态学特征；流式细胞术分析显示：2uM As_2O_3作用SKOV_3 WP=8 细胞72h，出现亚G1峰、S期和G2/M期细胞明显增加，细胞周期阻滞于S+G2/M期；10uM As_2O_3作用3AO细胞72h，亚G1峰出现，且周期阻滞于S+G2/M期，而低浓度2、5uM As_2O_3作用3AO，只有G2/M期细胞增加，并未出现亚G1峰，提示As_2O_3对人卵巢癌细胞SKOV_3、3AO均有明显周期特异性生长抑制作用；低浓度As_2O_3主要干扰3AO细胞G2/M期的通过而抑制细胞增殖、并未启动凋亡，高浓度As_2O_3才启动了对3AO细胞的凋亡，说明As_2O_3对卵巢癌细胞株凋亡的诱导可能在作用剂量、细胞株类型及凋亡调控机制方面存在特异性。 2．本实验对人卵巢癌细胞SKOV_3、3AO线粒体跨膜电位（Δψm）检测显示，不同浓度As_2O_3均可诱导SKOV_3、3AO细胞Δψm的降低，且随浓度升高，下降愈明显，荧光显微镜下检测线粒体荧光强度变化发现As_2O_3作用SKOV_3、3AO 72h，线粒体荧光强度均明显减弱；电镜也观察到As_2O_3作用SKOV_3、3AO 72h后，线粒体明显肿胀，内嵴消失，基质透明呈气球样变，上述结果提示线粒体Δψm的下降是As_2O_3诱导细胞凋亡的重要环节。免疫流式和免疫组化检测显示As_2O_3能抑制SKOV_3、3AO细胞的Bcl-2蛋白表达。结合Bcl-2与活性氧在细胞凋亡中的密切关系，提示As_2O_3在诱导细胞凋亡中对Bcl-2蛋白表达的抑制，可能解除了Bcl-2抗氧化能力，从而使活性氧含量升高，直接损伤线粒体Δψm，从而导致凋亡发生。 3．探讨As_2O_3诱导SKOV_3、3AO凋亡中cPKCα与Ras信号途径 WP=9 的关系中发现，As_2O_3降低了SKOV_3 72h时H-Ras mRNA表达水平，而略降低了3AO 12h、24h、72h时H-Ras mRNA表达水平；As_2O_3明显升高cPKCα表达，cPKCα被持续活化；SKOV_3、3AO细胞C-Raf mRNA表达水平在As_2O_3作用24h时明显升高，C-jun mRNA表达则在As_2O_3作用12h、24h、72h时持续升高，上述结果提示H-ras可能未参与As_2O_3诱导的卵巢癌细胞凋亡信号传导途径，它并未直接激活C-Raf，而由活化的cPKCα参与C-Raf的激活，将细胞凋亡信号传递给C-jun，使其持续活化，最终将凋亡信号传递入核，诱发了细胞凋亡。 4．研究As_2O_3对SKOV_3、3AO细胞周期及凋亡调控相关基因的影响，结果表明：As_2O_3降低了SKOV_3 CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE 蛋白表达水平，而只降低了3AO CyclinA、CyclinB1蛋白水平，CyclinD1、CyclinE未见明显变化，提示As_2O_3不仅参与了SKOV_3细胞G2/M期周期调控因子的调节，也对G1/S期调控因子发挥作用，对3AO细胞只参与G2/M期调控因子的调节，说明As_2O_3对不同类型肿瘤细胞的细胞周期调控具有差异性。As_2O_3对SKOV_3、3AO细胞p21 mRNA、p16蛋白表达增强，提示p21、p16参与了As_2O_3对SKOV_3、3AO细胞周期的阻滞，还可能参与了细胞凋亡的发生。As_2O_3对SKOV_3、3AO凋亡相关基因bcl-2、C-myc的研究表明：As_2O_3处理SKOV_3、3AO细胞后Bcl-2蛋白表达呈明显减低趋势，C-myc mRNA转录表达水平也逐渐降低，提示Bcl-2蛋白表达，C-myc mRNA转录水平的下降是As_2O_3诱 WP=10 导SKOV_3、3AO细胞凋亡的分子机制之一。 5．研究As_2O_3诱导卵巢癌细胞凋亡对其端粒酶活性及其作用机制的影响，结果显示：不同浓度As_2O_3作用SKOV_3、3AO细胞，其端粒酶活性随作用浓度的升高呈不断下降趋势，呈时间和浓度依赖性；RT-PCR检测端粒酶催化亚单位（hTERT）mRNA表达发现，As_2O_3作用SKOV_3、3AO 12h 、24h、72h时，均逐渐降低了hTERTmRNA表达水平，与端粒酶活性的下调变化相一致，提示端粒酶活性和hTERT mRNA表达在As_2O_3诱导SKOV_3、3AO细胞凋亡过程中共同发挥作用，两者密切相关，是诱导细胞凋亡的分子机制之一。