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皮肤创伤愈合相关差异表达基因的克隆、筛选及鉴定

简华刚  
【摘要】: 背景及目的:随着现代分子生物学的发展,创伤愈合与组织修复正逐渐成为创伤研究中最具潜力和引人注目的部分。机体防御外界刺激、损伤的第一道屏障为皮肤,因而皮肤创伤愈合是创伤愈合与组织修复中不可缺少的部分。皮肤在发育上是由三类胚胎细胞分化,由多种类型的细胞(构成表皮和真皮)组成,起到正常的生理功能。皮肤创伤后,由构成皮肤的各种细胞及其细胞外基质参与的一个复杂的皮肤愈合、修复过程,大约有数百种基因表达改变,以协调各种细胞在愈合、修复中的生物学行为。尽管人们在皮肤创伤愈合的研究中,从不同侧面做了大量的研究工作,但离全面了解在皮肤创伤组织愈合过程,尤其是愈合过程中基因表达、调控还有很大距离。本研究的目的在于通过构建人皮肤创伤愈合期与正常皮肤组织差异表达基因消减cDNA文库,筛选、鉴定出在皮肤组织愈合期差异表达基因的cDNA片段,并对其在皮肤组织修复过程中的表达情况做一个初步的探讨。 方法:(1)用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,以创伤愈合期(伤后5天)人皮肤组织作为检测子(Tester),以正常人皮肤组织作为驱赶子(Driver),通过提取创伤愈合期和正常人皮肤组织的mRNA,经逆转录合成第一、二链cDNA;用限制性内切酶Rsa Ⅰ将双链cDNA酶切成小片段,再将Tester cDNA分成两份,分别连上不同的接头,与Driver cDNA进行两轮消减杂交及两轮PCR;最终将特异性扩增的PCR产物通过T/A克隆到T-载体上,构建人皮肤创伤愈合期与正常皮肤组织差异表达基因消减cDNA文库。(2)利用 重庆医科大学博士研究生学位论文 — — a互补原理,经蓝白菌落初步筛选阳性克隆;再用PCR技术对阳性克 隆作进一步筛选,获得真阳性克隆;门)将筛选到的阳性克隆进行杂 交筛选,最后确定的差异表达片段;N)对差异表达的片段进行序列 解析,将序列结果经过NCBI BLASTN信息途径进行同源性检索和比 对,检索的数据库包括GenBank+EMBL+DDBJ+PDB非重复数据库 (Non-redundant GenBank+ EMBL十 DDBJ + PDB Sequences)和 GenBank EST*重复数据库(Non-redundant Database of GenBank EST Division) K)用Northern杂交的方法验证本研究的可靠性,并比较 了4种筛选出来的差异表达基因伯角蛋白6e、角蛋白6a、connexin 26和这个新知基因片段),在正常、伤后1小时和后5大的人皮肤组织 中的转录表达情况。 结果:()用SSH技术成功构建了人皮肤创伤愈合期(伤后5天) 与正常皮肤组织差异表达基因消减CDNA文库。门)经蓝白菌落初步 筛选阳性克隆128个,再用PCR技术进一步筛选,获得真阳性克隆70 个。D)阳性克隆经杂交筛选,最后确定的差异表达基因片段38个。 K)38个差异表达的基因片段序列解析证实,37个序列与己知的人 全长基因具有很高的相似性乃7%~100%人 另有 1个和人类的基因 仅仅具有部分相似性,表明它是未被克隆的人基因对应的EST片段, 该片段长665hp,向GenBank的dbEST数据库提交序列,并获得注册 (GenBank登录号:BM499225)。(5)己知基因中角蛋白6e和p-2- 微球蛋白未见与创伤组织愈合、修复的相关报道。历)Northern杂交 验证发现,验证的4种基因片段在伤后1小时和伤后5大的人皮肤组 织中的表达有显著差异。 结论:()SSH为筛选差异表达基因的有效方法,利用该方法成 功构建了人皮肤创伤愈合期与正常皮肤组织差异表达基因消减CDNA -2- 重庆医科大学博士研究生学位论文 一 文库。u)蓝白菌落筛选及PCR技术相结合,可快速准确地筛选阳性 克隆。门)序列解祈证实在38个差异表达片段中,37个序列与己知的 人全长基因具有很高的相似性;另有1个和人类的基因仅仅具有部分 卞似性,该片段长665hp,向GenBank的dbEST数据库提交序列,并 ,获得注册(GenBank 登录号:BM499225\ 推测分析该片段是和 beta.Actin具有部分相似性的新基因序列的一段。已知基因中角蛋白6e 和p毛-微球蛋白以前末见与创伤组织愈合、修复的相关报道,但本研 究发现它们也在人皮肤愈合中有差异表达。H)Northern杂交验证发 现,验证的4禾基因片段(巨角蛋白 6e、角蛋白 6a、connexin 26和 这个新知基因片段)在伤后1小时和伤后5天的人皮肤组织中的表达 有显著差异。并初步表明它们在创伤组织愈合、修复的过程中起重要 作用。


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