卡介苗、γ-干扰素及维生素A对毛细支气管炎患儿免疫功能的影响

【摘要】： 目的 毛细支气管炎（简称毛支）是婴儿常见的下呼吸道感染性疾病，约1/3以上的患儿可能日后发展为哮喘，近年有上升的趋势，严重危害患儿的身体健康及生存质量。其发病机理还不清，可能与辅助性T细胞TH1 /TH2的功能失衡，即TH2的功能亢进有关。传统的治疗方法为抗炎、对症止喘，支气管扩张剂及糖皮质激素。糖皮质激素的作用机制目前尚不明了，虽可暂时缓解高气道反应症状，但TH1 /TH2功能紊乱状态仍然存在，不能预防毛支后的喘息发作。甚至有资料表明糖皮质激素增强TH2的细胞功能的报道。本研究试图通过体内外干预研究观察卡介苗（BCG）、干扰素（IFN-γ）、维生素A（VitA）对毛支患儿外周血单个核细胞（PBMC）细胞因子及CD4细胞膜表面蛋白淋巴细胞活化基因-3（LAG-3）mRNA表达的影响；并观察干预后毛支患儿PPD的反应性，随访喘息发作情况，探讨BCG干预对毛支患儿免疫功能状态的影响及其作用机制，为预防毛支患儿日后发生喘息和哮喘提供新的途径及理论依据。 WP=8 方法 1． 45例住院毛支患儿和21例门诊体检的健康幼儿作为研究对象。受试者均于新生儿期接种过BCG。 2． 体外使用不同浓度BCG，IFN-γ，Vit A或三者联合刺激毛支患儿PBMC 或单核细胞。 3． 于毛支急性期接种BCG 0.125ml，合并或不合并使用IFN-γ (1百万单位X 5天)/Vit A（2.5万单位X14天）。 4． 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定体外单核细胞和PBMC培养上清液细胞因子IL-18，IL-12，IL-10，IL-4，IFN-γ和血清IgE。 5． 采用墨汁吞噬试验观察单核细胞吞噬功能，免疫组化法检测单核细胞活性标记物CD11b。 6． RT-PCR法半定量测定PBMC LAG-3mRNA表达。 7． 观察干预前及干预3个月后PPD皮试硬结直径的大小及随访平均一年，观察喘息发作情况。 结果 1．毛支患儿体外培养上清液单核细胞源性细胞因子IL-18和IL-12明显低于健康对照幼儿，TH1细胞表面标记LAG-3mRNA表达低下。与健康对照组比较，体外培养上清液IL-4 、IL-10和血清IgE显著增高。PBMC培养上清液IFN- WP=9 γ水平虽低于正常对照组，但无统计学意义。 2．体外试验表明BCG浓度为50μl/ml，培养72小时，单核细胞吞噬功能及膜表面蛋白CD11b表达最强。IL-12、IL-18、IFN-γ水平较处理前升高，而IL-10和IL-4下降。 BCG为75μl/ml时， IL-12、IL-18、IFN-γ产生水平仍较高，但抑制IL-10及IL-4的作用不明显。 3. VitA及IFN-γ对毛支患儿单核细胞膜表面蛋白CD11b表达无影响。VitA可在体外显著增强毛支患儿单核细胞产生IL-10；但促使IL-12、IL-18及IFN-γ的水平进一步下降，LAG-3mRNA的表达降低，IL-4的水平轻微下降。 4. 外源性IFN-γ降低毛支患儿上清液IL-10和IL-4水平，提高IL-12、IL-18及IFN-γ的水平，增强PBMC LAG-3mRNA表达。 5．BCG、IFN-γ和VitA联合干预对细胞因子体外产生的影响与单用BCG或IFN-γ相似。 6.BCG接种和BCG接种合并IFN-γ/VitA干预后PPD皮试反应程度（5.5±2.4mm）均强于干预前(1.1±0.7mm)及毛支对照组恢复期(2.8±1.6mm)，联合干预尤为明显(9.0±4.2mm)。 7．经过平均1年的临床随访，BCG接种干预后喘息发作率及喘息持续时间均明显低于未进行BCG接种的毛支对照组。合并或不合并IFN-γ/VitA治疗与喘息发作率及喘息持续时 WP=10 间无关。 8．BCG接种干预后体外IL-18 水平和TH1膜表面蛋白分子LAG-3mRNA表达明显升高，IL-12及 IFN-γ达到健康对照幼儿的范围，而IL-10、IL-4及血清IgE明显降低。 9．PPD皮试反应与IL-18、IL-12呈显著正相关，与IFN-γ正相关性较小；与IL-4及IgE呈显著负相关；与IL-10呈负相关。 结论 1.毛支患儿存在TH1功能低下和TH2功能亢进的免疫功能失调现象。TH1/TH2功能失调的原因可能与抗原呈递细胞（树突状细胞）分泌IL-12和IL-18不足有关。 2．BCG的用量不同，培育时间不同，体外单核细胞的吞噬功能及膜表面蛋白CR3/CD11b的表达不同，分泌细胞因子类型则不同。BCG为50μl/ml培养72小时，单核细胞的吞噬活性及CR3表达最强。 3. IFN-γ能促进TH1细胞功能，纠正TH2占优势的免疫失衡状态；对CR3/CD11b表达无影响，可能作为刺激信号影响单核细胞功能。 4. VitA可能通过促进单核细胞产生IL-10，抑制IL-12及IL-18的产生，从而抑制TH1类细胞因子IFN-γ的产生及LAG-3mRNA的表达，加重毛支患儿TH1/TH2的失衡。VitA也可 WP=11 能通过促进IL-10的产生而诱导Tr1的活性, 调节TH1/TH2, 发挥抑制TH1细胞的功能。. 5．体内BCG接种可降低喘息发作率，增强毛支患儿PPD皮试强度，纠正毛支患儿体内的TH1/TH2紊乱状态使之趋于平衡。 6．PPD皮试反应程度与IL-18、IL-12、IFN-水平呈正相关，与IL-10、IL-4呈负相关，提示PPD皮试直径大小代表TH1免疫功能状态。BCG接种干预后皮试硬结均值5 mm，与临床效果一致，因此，将其作为判断干预效果的临床指标。 7．BCG接种合并IFN-γ/VitA联合干预较单独BCG接种更能增强PPD皮试反应，但在预防毛支患儿日后发生喘息方面并未显示优势。