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鲍曼不动杆菌医院感染流行病学调查及耐药机制研究

刘丁  
【摘要】:目的 了解鲍曼不动杆菌医院感染现状及危险因素;建立有关鲍曼不动杆菌基因分型方法;研究鲍曼不动杆菌产β-内酰胺酶的特性和对喹诺酮类药物的耐药机制。 方法 1. 对鲍曼不动杆菌引发的医院感染140例患者的感染情况进行调查,并用WHONET4进行药敏分析,采用1∶1病例对照研究其感染的危险因素。 2. 选用特异性的ERIC和噬菌体M13的核心序列为引物,对临床分离的鲍曼不动杆菌进行PCR分型,比较其分辨率、实用性等,并用脉冲场电泳技术对鲍曼不动杆菌分型。 3. 用Nitrocefin显色法筛查鲍曼不动杆菌产β-内酰胺酶的情况,并用等电聚焦电泳对其产酶种类进行初步的估计;再用三维试验和纸片相邻法进行AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶的检测,最后用特异性酶引物对质粒DNA和染色体DNA进行PCR扩增,以确定产酶基因的位置;同时,对其酶稳定性进行测定。 4. 用E-test法测定鲍曼不动杆菌对环丙沙星的MIC,选出高耐株组、耐药株组和敏感株组,分别对各组进行了外膜蛋白电泳、药物摄取、超微结构等实验研究,并用PCR对靶位点的gyrA和parC基因进行扩增,用内切酶HinfⅠ对保守区进行酶切和PCR-SSCP技术筛查其基因突变,最后用序列分析明确突变基因。 结果 1.鲍曼不动杆菌医院感染率较高,为5.4‰,其中以创伤科(含ICU病房)和呼吸科最常见,分别占感染数的50.2%,、35.64%;药敏结果显示除亚胺培南外, 对其它抗生素的耐药率在50%以上;危险因素依次为病情(OR=8.691)、免疫抑制剂(OR=4.85)、机械通气(OR=3.68)、抗生素使用种类(OR=3.014)。 2.ERIC-PCR和M13-PCR将23株临床分离的鲍曼不动杆菌分型为5个和9个基因型;PFGE也能将鲍曼不动杆菌染色体DNA较好的分离。 WP=7 *本课题获全军“十五”医药卫生科研基金(编号01Q-096) 3.临床分离的23株鲍曼不动杆菌经Nitrocefin显色,均呈阳性,ESBLs为阴性,11株AmpC为阳性;等电聚焦提示有一条带pI在5.4处,另一条带pI大于9.0;23株菌均带有质粒,经PCR扩增结果显示质粒DNA上含有TEM-1编码基因;染色体DNA的PCR结果23株菌ampC基因均呈阳性;AmpC酶对亚胺培南和头孢吡肟的水解率最低,为15.7%和28.6%。 4.临床分离的23株鲍曼不动杆菌中,对环丙沙星高度耐药(≥32μg/ml)9株,耐药(≥4μg/ml)3株,敏感(=0.25μg/ml)11株;其中HR7株存在外膜蛋白的差异和药物聚积的下降,经CCCP处理后,接近为正常水平,超微结构并无明显变化;9株高耐菌均存在gyrA基因的突变,同时有5株还存在parC基因的改变;3株耐药菌只有2株有gyrA的变异。 结论 1.本地区鲍曼不动杆菌医院感染率较高,其中以创伤科(含ICU病房)和呼吸科最为突出。鲍曼不动杆菌对临床上常用的几类抗菌药物均呈较高的耐药性。 2.病情、免疫抑制药、机械通气、抗生素使用种类等4项是本地区鲍曼不动杆菌医院感染产生的独立危险因素。提示严格消毒和监测措施;正确使用免疫抑制剂;合理抗生素的使用,是控制其医院感染发生的重要手段。 3.细菌噬菌体M13核心区域片段、肠杆菌科重复片段ERIC均可作为特异性引物用于鲍曼不动杆菌的PCR分型,但M13优于ERIC;PFGE技术对鲍曼不动杆菌的分型更具优势。 4.鲍曼不动杆菌主要产TEM-1型酶和AmpC酶,其中质粒上携带bla-TEM基因,而染色体上存在ampC基因。对抗生素的水解实验可见,亚胺配能和头孢吡肟对AmpC酶具有稳定性较好,可作为临床上治疗产AmpC酶的鲍曼不动杆菌感染的有效药物。 5. 鲍曼不动杆菌对环丙沙星的耐药主要与GyrA蛋白的相应氨基酸突变有关,特别是突变发生在Ser83位时,能产生对环丙沙星的高水平耐药;同时,在部分高耐株中也存在ParC蛋白Ser80位的氨基酸突变,表明也与其高度耐药相关;此外,鲍曼不动杆菌耐药株中虽然存在外膜蛋白改变和药物的主动外运现象,但从本次研究看来不是其耐氟喹诺酮类药物的主要机制。


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