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线粒体DNA体突变在原发性乳腺癌中的研究重庆地区汉族人群线粒体DNA控制区遗传多态性研究

曹洋  
【摘要】:线粒体基质内含有的DNA,是细胞核外唯一存在的DNA。线粒体DNA(mtDNA)也呈双螺旋结构,但双链两端连接成环,组成双链闭合环状分子,全长16569个碱基对,包含了一个约1.1kb长的非编码区。mtDNA具有以下优点:mtDNA在细胞内拷贝丰富,因此检测更灵敏,能经受环境的影响;mtDNA的母系遗传的特征,使我们可以通过比对其母系亲属的mtDNA分型来确定或排除嫌疑人; mtDNA存在于细胞质内,能从缺乏细胞核的样本(如发干)中成功地提取mtDNA,进行分析。 本实验运用PCR产物直接测序、克隆测序及固定寡核苷酸杂交等方法对mtDNA控制区的群体遗传学及其在法医学中的运用进行研究。 1、在我们运用mtDNA进行个人识别、疾病诊断和突变检测时常常遇到两个问题,即标准化和无法准确地对含C延伸区的样本进行序列分析。我们从人外周血白细胞中提取mtDNA, PCR扩增后重组质粒,然后转化大肠杆菌JM109 中进行增殖,提取质粒DNA进行测序,构建人类mtDNA HVⅠHVⅡ区标准参照物细菌珠,并直接准确地对20个含C延伸区的样本进行了序列分析。因此,为本研究构建了标准化参照物,建立了直接测序和克隆测序方法。 2、采用3100遗传分析仪对PCR产物直接测序的方法,对重庆地区汉族群体111名无关个体mtDNA HVI区的遗传多态性进行研究。在这111名无关个体中,检测到110种单倍体型,其中有1种单倍体型含2个样本,该基因型是16304C。在HVI区16031-16482之间发现90处碱基变异,核苷酸变异主要是转换,转换与颠换之比为3.85。除了转换、颠转、插入外,我们还观察到12例缺失。其基因多样性为99.98%,两个无关个体的偶合率为0.92%。表明重庆地区汉族群体具有较高的遗传多态性,适用于法医个人识别及亲子鉴定。 WP=9 3、运用直接测序法研究重庆地区汉族群体109名个体的HVII区的遗传多态性。在109个个体中,我们发现70例在309后插入1-3个C,108例在315后插入一个C。除了转换、颠转、插入外,我们还观察到24例缺失。在109名无关个体中,检测到83种单倍体型,有13种单倍体型含2个以上样本,其中最多的8个样本具有同种基因型,基因型为263G 、309.1C、 315.1C。其基因多样性为99.0%,两个无关个体的偶合率为0.99%。我们发现在303-315这一C聚集区域存在长度异质型。结果显示在运用直接测序法测序时在该区域后产生的碱基重叠现象是由于长度异质型造成的,在该区的C数目多于8个时常常会发生长度异质型。 由此可见,mtDNA是一种良好的遗传标记,可以用于法医个人识别、亲子鉴定。 4、运用直接测序法和克隆测序法分别研究mtDNA的点突变异质型和长度异质型。运用直接测序法分析50名无关个体的血液、口腔上皮细胞、头发的mtDNA HVI、HVII区序列,发现每一个体这三种样本的序列都是一致的,未见异质型存在。对16名母系家族成员进行序列分析时,也未见异质型存在。对20例直接测序失败的无关个体进行克隆测序,发现同一个体的不同克隆的C延伸区的长度有差异,由此我们推断,这些个体在该区具有长度异质型。同时我们分别对5个个体的血液和头发进行克隆测序,得到的长度变异类型与从血液提取的mtDNA型类似。 通过本部分实验证实了运用直接测序的方法在C延伸区后产生模糊序列,以至于不能准确判读的原因是由于具有长度异质型造成。同时我们的实验数据也进一步证实了mtDNA的遗传机制,即在线粒体的传递过程中存在瓶颈理论。同时也为我们在法医个人识别中进行结果分析提供了理论依据。通过该部分实验表明,mtDNA的点突变异质型十分罕见,只存在长度异质型。由此证实mtDNA碱基序列分析具有很好的同一性及稳定性,适用于法医学检案及疾病诊断。 5、为了检测混合血样的DNA序列,我们将含三个无关个体DNA的混合样本的PCR产物根据T-A克隆的技术方法克隆到pGEM-T质粒,然后提取质粒DNA测序分析。除了一组各组分比例为1:1:18的混合物检测失败外,其余各组各组分的mtDNA HVI 区序列我们皆成功地检测到。因此,运用对PCR产物克隆后测序可以成功地解决混合血样的个体识别问题,能检测出混合样本中成分的最少含量10。 关键词  线粒体DNA(mtDNA),多态性,个人识别,异质型,混合血样


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