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重组腺相关病毒体外诱导人树突状细胞的研究

王雪燕  
【摘要】: 目的:分别构建携有hGM-CSF、hIL4和hTNFα基因的AAV病毒,依次将这些基因导入外周血单个核细胞(PBMC),使后者持续、有效地分泌相应的细胞因子来体外诱导DC,弥补外源性细胞因子半衰期短价格昂贵的缺点,为最终探求一种更经济、更方便的体外诱导获取DC的方法奠定基础。 方法:将携带有细胞因子的重组腺相关病毒载体(AAV/cytokine vector)与辅助质粒pHELPER共转染到293细胞内包装成重组腺相关病毒,测定病毒滴度。从健康人外周血中分离出单核细胞然后用病毒感染之,提取总RNA,以RT-PCR来检测三种细胞因子在mRNA水平的表达。另外用同样的方法从健康人外周血中分离出单核细胞,分成三组,一组用携有细胞因子的重组腺相关病毒依次感染PBMC,通过自分泌和旁分泌相应的细胞因子持续作用来培养DC;一组直接用hGM-CSF、hIL4和hTNFα作用PBMC培养DC;另外一组只加入293细 WP=8 胞裂解液培养PBMC。将这三组培养数天的细胞,通过动态观察、FACS分析检测CD表面标记分子(CD14、CD40、CD83、CD86)的表达,以及用混合淋巴细胞反应等,进行鉴定比较重组AAV和外源性细胞因子的作用差异。 结果:(1)成功包装病毒,并用非同位素(酶标)特异性探针斑点杂交法检测病毒滴度为107-108eg/ml。(2)提取感染病毒的PBMC细胞的总RNA,以RT-PCR检测到三种细胞因子mRNA的表达。(3)基因诱导培养的第十天可获得典型的DC。经光学显微镜和电镜观察及流式细胞仪分析证实,所诱导的细胞具有典型的形态和结构特征,有较高的表面标记分子(CD14、CD40、CD83、CD86)的表达。(4)MLR的检测表明,基因诱导的DC具有较强的刺激同种淋巴细胞反应的能力。 结论:(1)rAAV病毒能将外源基因导入真核细胞,有效和持续地表达,并减少了污染机会。(2)基因诱导可获取典型的DC细胞。(3)rAAV诱导DC是一种经济、方便和有效的体外诱导获取DC的方法。


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