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幽门螺杆菌vacA基因毒性片段与hpaA基因的原核表达及初步应用

刘淼  
【摘要】: 目的:通过基因工程技术获得重组幽门螺杆菌VacA毒性片段蛋白,为制备Hp感染的诊断试剂和研制疫苗提供有效抗原。以重组蛋白为抗原初步建立检测血清VacA抗体间接ELISA法,为制备检测Hp毒株感染的试剂盒奠定基础。 方法:通过BLAST比较国内Hp代表株的vacA基因毒性亚单位,找出高度同源性片段,按标准株AF050320 vacA基因序列设计引物,利用PCR技术从Hp基因组中扩增vacA基因毒性片段(v),插入原核表达载体pQE30上,转化表达受体菌DH5α,SDS-PAGE分析表达情况,Western blot检测其抗原性。Ni-NTA2+树脂纯化后,用重组蛋白免疫兔,Helico Blot试剂盒检测兔血清VacA抗体以鉴定其免疫原性。并以纯化的重组蛋白为抗原,建立检测血清VacA抗体间接ELISA法,以Helico Blot试剂盒为标准,确定该方法的特异性与敏感性。 结果: 1.重组表达质粒pQE30-V构建成功,序列分析所得序列完整,与文献报道的各中国菌株相比有高度同源性,而与标准株AF361700比较有1 .5%的bp及一个氨基酸发生变异;2. SDS-PAGE显示表达产 WP=8 物相对分子量为27 000,表达量为25%;3. Western blot显示该蛋白可被VacA(+)Hp血清所识别;4.SDS-PAGE分析表达蛋白既存在细菌裂解液上清中,又存在包涵体中,经Ni2+-NTA树脂纯化后,可得到纯度93%以上的蛋白质;5.通过Helico Blot试剂盒检测纯化蛋白的兔抗血清,证实有良好的免疫原性;6.用重组蛋白建立检测血清VacA抗体的间接ELISA法,敏感性与特异性分别是93.1%和92.5%。 结论:Hp vacA基因毒性片段表达成功,获得高纯度重组蛋白并具有良好的抗原性与免疫原性,为研制疫苗和制备诊断VacA(+)株感染试剂盒提供了可靠材料。以重组蛋白为抗原初步建立检测血清VacA抗体的间接ELISA法,敏感性、特异性高,为制备商品化的试剂盒奠定了基础。


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