超声波逆转肿瘤细胞多药耐药的体外实验研究

【摘要】： 肿瘤细胞多药耐药(multidrug resistance, MDR)是导致肿瘤化疗失败的主要原因, 有资料表明，90%以上肿瘤患者的死因与MDR有关, 因此如何逆转MDR是一个亟待解决的问题。理想的逆转措施应用具备以下特点：高效、无毒、能特异性地作用于肿瘤组织而对正常组织无害。目前常用的逆转剂与此标准尚有一定差距。如化学逆转剂， 虽体外试验显示其具有良好的逆转效果, 但较强的毒副作用限制了它的临床应用；基因治疗仅适用于机制较为单一的MDR，而多数MDR是由多种机制共同参与的。 超声波是一种高频振荡的机械波，因其频率高、波长短而具有如下特点：（1）方向性好；（2）可聚焦；（3）有一定的组织穿透性；（4）具有广泛的生物学效应；（5）作用方式及剂量可精确调控，因而是逆转肿瘤细胞MDR的理想手段。虽已有文献报道低强超声对肿瘤细胞MDR的逆转，但其资料多来自单一的超声参数（频率、声强、脉冲、照射时间固定），且不同研究者选用的超声参数差别很大。为此，我们系统地研究了超声波逆转效应对超声参数的依赖性，从中筛选出最佳参数组合，并将这种最佳组合用于逆转MDR，同时初步探讨其作用机制。 WP=9 第一部分 肿瘤细胞多药耐药模型的建立及耐药特性鉴定 目的 建立肿瘤细胞多药耐药模型并鉴定其耐药特性。方法 以人肝母细胞瘤细胞系HepG2为亲本细胞，分别采用阿霉素（adriamycin, ADM）大剂量冲击法和浓度梯度递增法诱导细胞耐药。光、电镜观察新建细胞系的形态学特点, MTT法检测细胞对药物的敏感性, Rh123摄入和外排试验测定P-gp功能，免疫组化法检测耐药蛋白P-gp、MRP和LRP，凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果 3个月后建立了两种耐药细胞系：大剂量冲击法建立的HepG2/ADMs和浓度梯度递增法建立的HepG2/ADMi。耐药细胞系在形态学上与亲本细胞无明显差别，但对ADM的耐药性增高，HepG2/ADMs和HepG2/ADMi对ADM的耐药倍数分别为30.5和51。同时，新建细胞系对从未接触过的VCR和VP-16也产生了耐药性，其耐药指数分别为40.16, 57.06和11.65, 15.53。耐药细胞对Rh123的摄入减少，外排增加。免疫组化染色可见P-gp、MRP、Bcl-2和Bax阳性。结论 新建细胞系HepG2/ADMs和HepG2/ADMi具有多药耐药特性，HepG2/ADMi 的耐药性高于HepG2/ADMs，其耐药机制主要由P-gp和MRP介导，Bcl-2和Bax也参与其中。 第二部分 超声波对细胞活力的影响及其亚致死剂量的筛选 目的 观察超声波对细胞活力的影响并测定其亚致死剂量。方法 用不同剂量的超声波照射HepG2和HepG2/ADMi细胞，台盼蓝拒染法检测细胞活力，MTT法检测细胞增殖能力，双层琼脂法测定克隆形成率，FCM进行细胞周期分析。结果 亚致死剂量与超声参数和细胞类型有关。频率0.8MHz，声强0.4302W/cm2 ，连续波超声对HepG2/ADMi的亚致死剂量为3.728J/cm2 。亚致死剂量照射后，台盼蓝染色法检测细胞活力90%, MTT法检测显示HepG2和HepG2/ADMi的存 WP=10 活率为80.33%和77.12%，3周后可恢复正常；HepG2和HepG2/ADMi对照组克隆形成率为50%和43%，亚致死剂量超声照射后降为40%和32%。细胞周期分析可见G0/G1期细胞阻滞。结论 超声波对细胞的亚致死剂量与超声波的参数和细胞类型有关。亚致死剂量虽不致细胞立即死亡，但可抑制其生长。这种抑制作用是可逆的，3周后可恢复正常。 第三部分 超声波逆转肿瘤细胞耐药优化参数的筛选 目的 筛选逆转肿瘤细胞耐药的最佳超声参数组合。方法 以细胞对Rh123的摄入为观察指标，在亚致死剂量下，分别观察频率、脉冲和声强对Rh123摄入的影响。结果 经0.4MHz, 0.6MHz, 0.8MHz, 1.7MHz超声照射后，HepG2细胞内Rh123的荧光强度分别为95.62, 100.37, 110.15和85.26。HepG2/ADMi细胞内Rh123荧光强度分别为91.45, 97.12, 106.54和81.11。 0.8MHz效果最佳（P 0.05）。在10% ~ 100% 10种脉冲中，60%脉冲优于其它脉冲。在四种声强(0.1666, 0.2413, 0.3656, 0.4302W/cm2)中以0.4302W/cm2效果最好。结论 0.8MHz、60%脉冲波和较高声强下逆转效果最好。 第四部分 超声波对肿瘤细胞多药耐药的逆转效应及其机制 目的 观察超声波对肿瘤细胞多药耐药的逆转效果并探讨其机制。方法 以最佳超声参数组合：频率0.8MHz, 脉冲比60%, 声强0.4302W/cm2 在亚致死剂量下对HepG2/AMDi进行照射，MTT法检测细胞对药物的敏感性，流式细胞术检测细胞对ADM的摄取，化学发光法检测ATP酶（adenosinetriphosphatase，ATPase）活性，RT-PCR检测MDR1，MRP和LRP的 mRNA，用流式细胞术和免疫组化法检测MDR1，MRP和LRP蛋白的表达，免疫组化法检测Bcl-2和Bax。结果 HepG2/AMDi细胞对ADM、VCR、VP-16的耐药指数由照射前的51、57.06和 WP=11 15.53下降为21、24和6，部分恢复了对化疗药物的敏感性。超声照射后，细胞对ADM的摄取增加，ATP酶活性受抑制。RT-PCR结果显示MDR1 mRNA，MRP mRNA水平下降，LRP mRNA无明显变化。流式细胞术和免疫组化检查也发现MDR1和MRP两种蛋白的表达量下降。免疫组化检查示Bax表达升高，Bcl-2/Bax比值下降。结论 超声波能有效逆转肿瘤细胞多药耐药，其逆转耐药的机制有：（1）提高细胞对药物