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急性脑梗死痫性发作兴奋性机制的实验研究

曾可斌  
【摘要】: 一、目的: 探讨急性脑梗死早期痫性发作兴奋性损伤机制及托吡酯干预效应。 二、方法 取成年雄性Wistar大鼠并预置海马电极,一周后线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉阻塞(MCAO),同时监测脑电活动并相应分为脑缺血组及痫性发作组,检测海马组织中氨基酸浓度,以及胶质谷氨酸转运体(GLT-1)的免疫表达; 采用钝性分离1日龄SD大鼠双侧海马,分离培养海马神经细胞,观察细胞生长过程及用抗神经丝200抗体免疫细胞化学方法鉴定。第9~15天采用膜片钳全细胞模式检测神经细胞的基本电生理特性,及对L-谷氨酸和GABA的效应;观察不同浓度谷氨酸(2.5μmol/L~1000μmol/L)对神经细胞兴奋性影响及其作用特点;短时间、低浓度谷氨酸(5μmol/L)对神经细胞膜被动电生理特性、自发放电的影响,诱导神经细胞反复痫性放电,以及用吖啶橙/溴化乙锭染色法检测神经细胞死亡率; 观察托吡酯急性给药或预处理,对原代培养海马神经细胞痫性放 WP=8 电的影响。 三、结果 大鼠MCAO后2小时内,27.4%(17/62只)出现反复、阵发性棘波、慢波,即痫性放电。痫性发作组海马中天冬氨酸、谷氨酸和甘氨酸平均浓度显著高于脑缺血组(p0.05)。各组GABA平均浓度无显著性差异(p0.05)。在海马CA1和CA3区,痫性发作组GLT-1免疫表达显著低于脑缺血组(p0.05)。在齿状回,脑缺血组和痫性发作组GLT-1免疫阳性表达无显著性差异(p0.05)。 分离的海马细胞成活率大于93%,培养第7天后,细胞表面光洁,具有典型锥体神经细胞形态特征,并经抗神经丝200抗体免疫细胞化学方法证实,锥体神经细胞占78%,并可存活28天以上。 细胞封接成功率90%以上 (n500),静息膜电位为57.7+8.2mv(n=250)。膜电容Cm为15.9+3.6pF(n=62)、串联阻抗Rs为9.9+2.2MΩ(n=62),细胞膜的时间常数τ为157.8+51.6μs(n=62)。在全细胞模式下,神经细胞(n=216/250)的I-V曲线谱显示内向钠电流和外向钾电流。恒流刺激产生多个动作电位(n=69/72)。谷氨酸诱导海马锥体神经细胞出现可逆性去极化(n=26),并产生阵发性动作电位,GABA抑制电流刺激诱发的动作电位发放。 灌流不同浓度谷氨酸(5μmol/L~1000μmol/L)均可降低海马神经细胞膜电位,诱发可逆性去极化及动作电位,但灌流2.5μmol/L谷氨酸10分钟并不能诱发动作电位;不同谷氨酸浓度组间神经细胞膜电位及 WP=9 阈强度间有显著差异,高浓度组神经细胞的膜电位显著低于低浓度组,诱发动作电位的阈强度也显著低于低浓度组; 培养的神经细胞经谷氨酸作用,24小时后对照组及谷氨酸组神经细胞死亡率分别为13.3%和26.1%,谷氨酸组显著高于对照组(p0.05)。对照组(n=10)呈散发性自发性放电,频率低于3Hz占79.4%。谷氨酸组自发动作电位频率大于3Hz的放电占79.0%,并呈阵发性放电或簇性放电。谷氨酸(5μmol/L)处理后1~6天,海马神经细胞痫性放电百分率为62.5%~78.9%。 喷射苯妥英钠(10μmol/L)、托吡酯(20μmol/L,100μmol/L)抑制恒流刺激(40pA×200mSec)诱导海马神经细胞频发动作电位,动作电位分别减少100%、64.3%和75.0%。对于谷氨酸诱导海马神经细胞痫性放电,能被喷射苯妥英钠完全抑制(n=7/7),喷射托吡酯(100μmol/L)则部分抑制(n=5/8)。托吡酯(100μmol/L)预处理完全抑制谷氨酸诱导海马神经细胞(n=7)痫性放电。 四、结论 大鼠MCAO出现痫性发作,早期痫性发作占27.4%(17/62只); 海马组织中氨基酸浓度升高是MCAO后早期痫性发作原因之一; 大鼠MCAO后早期痫性发作与GLT-1免疫表达下调有关; 分离及原代培养大鼠海马神经细胞的操作方法简捷,有利于锥体神经细胞生长,可适用于膜片钳记录研究; WP=10 谷氨酸对海马神经细胞兴奋性呈浓度和时间依赖性。灌流谷氨酸10分钟内,5μmol/L可能是诱发海马神经细胞产生动作电位的最低浓度。 谷氨酸(5μmol/L)处理培养的海马神经细胞出现可逆性兴奋性损伤、或细胞死亡,海马神经细胞出现反复自发性痫性放电,具有急性脑梗死细胞损伤与癫痫放电特征。 托吡酯可干预体外模拟急性脑梗死谷氨酸所致的痫性放电(痫性发作); 托吡酯抑制海马神经细胞动作电位发放是一个渐进过程,具有时间依赖性和浓度依赖性,托吡酯预处理比喷射给药更能有效抗癫痫作用。


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