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neuB1基因失活空肠弯曲菌突变株的构建及其临床意义

向淑利  
【摘要】: 目的:运用基因克隆技术和同源重组原理,构建唾液酸合成酶基因1(neuB1基因)失活、脂多糖(LPS)核心寡糖中唾液酸(NANA)缺失的空肠弯曲菌(CJ)O:19突变株,以探索NANA基团在CJ相关格林-巴利综合征(GBS)发病机理中的重要作用。 方法:(1)突变载体的构建及鉴定:以neuB1基因失活的肠炎相关CJ O:2菌株基因组DNA为模板,PCR扩增含卡那霉素抗性基因(Km~R cassette)的neuB1基因突变片段——neuB1::Km~R,克隆到pGEM-T自杀载体,构建突变载体,限制性内切酶酶切和PCR鉴定;(2)突变株的构建与鉴定:用自然转化法,将突变载体转化CJ野生株后筛选出CJ突变株,对突变株及其同源野生株DNA进行PCR和RT-PCR鉴定。突变株连续传代培养25代后,以PCR和RT-PCR鉴定其稳定性;(3)SDS-PAGE电泳方法分析CJ LPS,酸性茚三酮反应法和过碘酸-间苯二酚反应法检测CJ LPS中NANA基团;(4)霍乱毒素B亚单位(1)(CTB) 重庆医科大学博士学位论文 结合试验检测CJ菌体裂解物及LPS中神经节昔脂GMI模拟结构。 结果:(l)突变载体pGEM一neuB l::Km“的构建与鉴定:PcR扩增 得到片段大小2259bp的neuBI突变片段。双酶切和以突变载体为模 板的PCR扩增,证实neuBI基因突变片段~euBI::KmR插入到 pGEM一T载体中;(2) neuBI基因失活CJ 0:19突变株的构建及鉴定: 突变载体转化CJO:19菌株后筛选出突变株,neuBI基因PCR产物在 野生株和突变株的大小分别为630bP和2 1 3obP左右,二者相差约 1500bP,与Km“cassette的碱基序列长度相符。PcR产物测序显示KinR cassette插入neuBI基因中,K刀IR cassette含转录启动子、无终止子且 转录方向与neuBI一致,表明该种插入方式不影响neuBI的下游基因 活性。Rl’- pcR扩增产物在野生株为630bp,在突变株则为阴性。连续 培养25代后,突变株保持neuBI基因失活性质不变;(3)SDS一PAGE显 示突变株LPS的分子量小于野生株。酸性荀三酮反应法和过碘酸一间 苯二酚反应法均证实,野生株LPS存在唾液酸而突变株已缺失;(4) 野生株菌体裂解物及其LPS能结合CTB,但突变株不能。 结论:(l)运用pGEM一T自杀载体和基因克隆技术,成功构建neuBI 基因失活、肠炎相关CJ 0:2突变株DNA的neuBI基因突变载体 pGEM一neuB l::Km“;(2)运用同源重组原理,成功构建neuBI基因失活 的GBs相关cJO:19突变菌株;(3)突变株的脂多糖外核心寡糖中唾液 酸基团已被消除;(4)与野生株相反,突变株LPS不存在GMI模拟结 构,表明LPS中唾液酸基团的缺失破坏了CJ LPS与GMI间的分子模 重庆医科大学博十学位论文 拟性;(5)neuBI基因失活的CJ突变株成功构建,从分子结构角度证实 有关CJ诱发GBS的分子模拟和交叉免疫发病机理的长期推论,而激 活此种交叉免疫的关键抗原成分是CJ LPS上的NANA基团和周围神 经GMI等神经节昔脂表位;(6)该突变株的成功构建,还为进一步研制 无神经免疫性损伤的CJ疫苗奠定了良好基础。


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