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bcl-2与c-erbB-2反义寡核苷酸联合转染治疗鼻咽癌的实验研究

李兵  
【摘要】: 目的:观察bcl-2与c-erbB-2基因反义寡核苷酸联合转染对人鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞株HNE-1细胞增殖的影响。方法:人工合成并经全硫代磷酸化修饰的bcl-2与c-erbB-2基因反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)与脂质体(lipofectin,Lip)混合制备成复合物处理人鼻咽癌细胞株HNE-1,并把实验分为七组:(Ⅰ)正常对照组、(Ⅱ)c-erbB-2正义寡核苷酸+脂质体组、(Ⅲ)bcl-2正义寡核苷酸+脂质体组、(Ⅳ)c-erbB-2反义寡核苷酸+脂质体组、(Ⅴ)bcl-2反义寡核苷酸+脂质体组、(Ⅵ)bcl-2反义寡核苷酸与c-erbB-2反义寡核苷酸+脂质体(全剂量)联合组和(Ⅶ)bcl-2反义寡核苷酸与c-erbB-2反义寡核苷酸+脂质体(半剂量)联合组。利用流式细胞仪检测各实验组的细胞周期以及bcl-2与c-erbB-2蛋白表达;利用电子显微镜镜观察各实验组细胞形态学改变;利用MTT试验与克隆(集落)形成试验观察各实验组细胞增殖情况。 结果:实验组与对照组比较,S期(DNA合成期)有逐渐延长的趋势,其中bcl-2反义寡核苷酸与c-erbB-2反义寡核苷酸+脂质体(半剂量)联合组最为明显。从细胞形态学观察:反义治疗组观察到线粒体肿胀、凋亡等现象,而bcl-2反义寡核苷酸与c-erbB-2反义寡核苷酸+脂质体(半剂量)联合组最为典型。MTT试验与克隆(集落)形成试验观察到反义治疗组与其它组细胞增殖抑制率有显著差异(p﹤0.05),而bcl-2反义寡核苷酸与c-erbB-2反义寡核苷酸+脂质体(半剂量)联合组(增殖抑制率达到了90.12%)与其它组细胞增殖抑制率有极显著差异(p﹤0.01)。流式细胞仪检测各实验组的bcl-2与c-erbB-2蛋白表达发现反义治疗组较其它组明显下调,而bcl-2反义寡核苷酸与c-erbB-2反义寡核苷酸+脂质体(半剂量)联合组bcl-2与c-erbB-2蛋白表达与其它组有极显著差异(p﹤0.01)。结论:bcl-2与c-erbB-2基因反义寡核苷酸转染对人鼻咽癌细胞株HNE-1细胞增殖有抑制作用,并能下调bcl-2与c-erbB-2蛋白表达,而联 WP=9 合转染的增殖抑制作用更为明显。 关键词:鼻咽癌, 基因, 反义寡核苷酸, 联合转染 第二部分 目的:观察bcl-2与c-erbB-2基因反义寡核苷酸联合转染对顺铂(cisplatin,DDP)诱导的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞株HNE-1细胞凋亡的影响。 方法:人工合成并经全硫代磷酸化修饰的bcl-2与c-erbB-2基因反义寡核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)与脂质体(lipofectin, Lip)混合制备成复合物处理人鼻咽癌细胞株HNE-1,并把实验分为八组:(Ⅰ)空白对照组、(Ⅱ)脂质体+DDP、(Ⅲ)c-erbB-2正义寡核苷酸+脂质体组+DDP、(Ⅳ)bcl-2正义寡核苷酸+脂质体组+DDP、(Ⅴ)c-erbB-2反义寡核苷酸+脂质体组+DDP、(Ⅵ)bcl-2反义寡核苷酸+脂质体组+DDP、(Ⅶ)bcl-2反义寡核苷酸与c-erbB-2反义寡核苷酸+脂质体(全剂量)联合+DDP组和(Ⅷ)bcl-2反义寡核苷酸与c-erbB-2反义寡核苷酸+脂质体(半剂量)+DDP联合组。利用流式细胞仪检测各实验组bcl-2与c-erbB-2蛋白表达;利用电子显微镜镜观察各实验组细胞形态学改变;利用末端脱氧核苷转移酶(Tdt)介导的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)末端标记法(TUNEL)原位观察细胞凋亡,并计算平均凋亡指数(AI)。 结果:流式细胞仪检测各实验组的bcl-2与c-erbB-2蛋白表达发现反义治疗组较其它组明显下调。电子显微镜观察发现反义治疗组出现以下改变:胞浆内脂滴较多,出现髓样结构,线粒体肿胀崩解,溶酶体大量出现;细胞核内染色质边集、可见脂滴、空泡化改变;细胞核的固缩变形,凋亡小体和凋亡细胞清晰典型。TUNEL检测发现:第2、3、4组凋亡指数(AI)无明显差异(p0.05), 第5~8组较1~4组AI有极显著差异(P0.01),其中第8组凋亡指数明显高于其余各组(P0.01)。结论:bcl-2与c-erbB-2反义寡核苷酸联合转染能促进顺铂诱导的鼻咽癌细胞凋亡,表明鼻咽癌的综合治疗、基因治疗并不排斥其它治疗手段。


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