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结核分枝杆菌DNA疫苗对小鼠结核病的治疗作用

江山  
【摘要】: 目的: 本研究拟构建编码结核分枝杆菌H37Rv Ag85B、MPT64以及二者融合基因(AM)的DNA疫苗,建立小鼠结核病模型;探讨上述DNA疫苗对小鼠结核病的治疗作用,IL-12质粒对所构建DNA疫苗的佐剂作用以及DNA疫苗对抗痨药物治疗结核病的免疫辅助作用;为新型结核病免疫治疗措施的提出提供理论和实验依据。 方法: 1、用PCR和基因克隆技术构建真核表达质粒pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM;MPT64、Ag85B编码基因亚克隆入原核表达质粒pET32a中, 纯化重组的MPT64和Ag85B蛋白,制备MPT64与Ag85B抗血清;pcDNA3.1(+)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM转染COS-7细胞,用RT-PCR、ELISA和斑点印迹的方法鉴定目的基因的表达;pcDNA3.1(+)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/AM免疫C57BL/6小鼠,ELISA法测量免疫后相应的PPD特异性抗体和脾淋巴细胞IL-4 以及IFN-γ分泌水平,MTT法检测PPD特异性脾淋巴细胞增殖能力,评价 DNA疫苗的免疫原性。 2、不同菌量的结核分枝杆菌H37Rv经尾静脉感染C57BL/6 WP=10 小鼠,4周后通过脾、肺组织结核分枝杆菌培养, 脾、肺组织抗酸染色以及组织病理检测对所建立的结核病动物模型进行鉴定;同时观察不同菌量感染后12周时小鼠的生存状态,从而选择合适的感染菌量。 3、小鼠感染结核分枝杆菌H37Rv 4周后,pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM肌注治疗,一次/2周,共4次;取小鼠肺、脾组织,通过组织荷菌量、器官重量指数(WI)、组织病理检测等指标评价其治疗作用;ELISA法对脾细胞PPD特异性细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-4进行检测,初步分析DNA疫苗治疗作用的免疫学机制。 4、小鼠IL-12真核表达质粒与pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64 和pcDNA/AM共同应用于对小鼠结核病的治疗(50:50),分析肺、脾组织荷菌量、器官重量指数、组织病理以及脾细胞PPD特异性细胞因子等指标的改变,观察IL-12对结核分枝杆菌DNA疫苗的基因佐剂作用。 5、pcDNA/Ag85B与抗痨药物INH、PZA共同应用治疗小鼠结核病,感染12周后对肺脾组织荷菌量、器官重量指数、组织病理等指标进行观察,了解结核分枝杆菌DNA疫苗对抗痨药物治疗结核病的免疫辅助作用。 结果: 1、经过限制性内切酶酶切及DNA双向测序证实 pcDNA/MPT64、pcDNA/Ag85B和pcDNA/AM真核表达质粒构建成功; WP=11 用重组的MPT64和Ag85B蛋白制备的鼠抗MPT64与Ag85B血清效价分别为1:32和1:64;重组质粒转染COS-7细胞后, MPT64、Ag85B多克隆抗体通过ELISA法检测到细胞培养上清液MPT64、Ag85B的表达,对照组为阴性反应;pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/AM免疫C57BL/6小鼠, 末次免疫后4周各组PPD特异性抗体水平均有不同程度增高,脾淋巴细胞PPD特异性IFN-γ分泌水平以及脾淋巴细胞增殖能力均增高。 2、小鼠感染结核分枝杆菌H37Rv 4周后,肺、脾组织均培养出结核分枝杆菌,组织抗酸染色发现抗酸杆菌,组织病理分析发现: 肺组织充血、实变,肺泡间隔消失,大量巨噬细胞和淋巴细胞浸润,肺泡腔内有吞噬了渗出物的泡沫细胞出现,有散在的类上皮细胞性增生出现。感染12周时,感染菌量为0.1 mg、0.05 mg的实验组7只小鼠均存活,但伴有精神萎靡、口鼻分泌物增多等现象。 3、在小鼠结核病模型第一次治疗后2个月, pcDNA/Ag85B治疗组肺、脾组织荷菌量与对照组比较分别下降1.2和0.7log, 差异有显著性(P0.01),肺、脾WI显著低于对照组(P0.05), 病变范围局限,仅局部区域有渗出性改变,病变部位见大量泡沫细胞;其它治疗组与对照组之间结果无显著性差异。pcDNA/Ag85B治疗组IFN-γ、TNF-α水平较对照组均升高(P0.05), IL-4水平与对照组比较差异无显著性(P0.05);pcDNA/MPT64 治疗组TNF-α水平较对照组升高(P0.01),IFN-γ、IL-4水平差异无显著性; WP=12 pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64 治疗组仅有IFN-γ水平升高(P0.05),TNF-α、IL-4水平与对照组比较差异无显著性;pcDNA/AM 治疗组IFN-γ水平较对照组显著升高(P0.001),但TNF-α水平与对照组比较差异无显著性(P0.05),且IL-4水平较对照组显著升高(P0.001)。 4、在小鼠结核病模型第一次治疗后2个月,psIL-12 治疗组肺、脾组织荷菌量较NS、空质粒对照组下降 (P0.05),脾WI显著低于对照组(P0.05),肺WI与对照组比较差异无显著性, 病变范围较局限,以浆液性渗出改变为主,大部分肺泡结构正常。pcDNA/Ag85B+ psIL-12 组肺、脾组织荷菌量较NS、空质粒和psIL-12对照组下降 (P0.05),但与 pcDNA/Ag85B 组比较差异无显著性(P0.05), 肺、脾WI与对照组比较差异无显著性, 肺组织病变范围,程度与psIL-12、pcDNA/Ag85B组相似。pcDNA/MPT64+ psIL-12 、pcDNA/AM+ psIL-12 与对照组比较各项指标无显著性差异。psIL-12治疗组脾淋巴细胞特异性IFN-γ、TNF-α水平较对照组升高(P0.05),IL-4水平与对照组比较差异无显著性(P0.05)。 5、在感染结核分枝杆菌H37Rv后12周, 各治疗组肺、脾组织荷菌量、WI较感染组有显著下降,但pcDNA/Ag85B+INH+PZA与INH+PZA治疗组间结果并无显著性;pcDNA/Ag85B+ INH+PZA肺部病理改变与INH+PZA治疗组相似。 WP=13 结论: 1、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcD


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