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重组腺病毒载体携带mdr1反义RNA靶向逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究

石毓君  
【摘要】:肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内,尤其是 亚洲和非洲发病率最高的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,预后极差。 临床统计数据表明,全世界每年有 500-1,000 万新发病例,在亚洲以及 非洲部分地区,每 10 万人口中约有 500 人罹患此病。 出现症状的 HCC 患者,5 年生存率不到 5%,HCC 对放疗化疗均 不敏感,目前包括手术为主的综合治疗方案亦难以显著改善预后。大 多数研究认为,仅无临床症状的小肝癌,经过手术或非手术治疗,能 获得相对较长的生存期。因此,针对进展期 HCC,寻找新的治疗方案 迫在眉睫。目前,人们对 HCC 发病及其浸润转移机制已经有了较深入 认识,随着现代分子生物学理论和技术的进步,诸如分子诊断、基因 治疗、生物治疗等技术将成为临床攻克 HCC 的重要手段。 近年来,针对恶性肿瘤的基因治疗或生物治疗,已经设计了多种方 案。包括抑癌基因治疗、基因修饰瘤苗、免疫基因治疗、自杀基因治 疗等。针对恶性肿瘤中有害基因的高表达,运用反义技术、核酶或新 兴的 RNAi 技术(RNAinterference),抑制甚至完全封闭有害基因已经显 示了极具前景的应用价值。 4 WP=10 重庆医科大学博士学位论文 肿瘤临床治疗过程中,由于肿瘤细胞逐渐产生的对多种化疗药物极 不敏感,成为化疗失败的主要原因。而 HCC 细胞中与化疗药物耐受相 关基因的高转录、高表达成为 HCC 细胞耐药的主要原因。这些基因主 要是多药耐药基因(multidrug resistance gene, mdr1)和多药耐药相关蛋 白基因(multidrug resistance-related protein gene,MRP)。mdr1 基因位于 人染色体 7q21~23,具有 28 个外显子,cDNA 全长 4.5kb,编码的 P-gp 有 1280 个氨基酸,分子量 170 kD,故又称为 P-gp170。 P-gp170 属于 ATP 依赖性转运蛋白超家族成员,为具有泵功能的跨膜蛋白,能利用 ATP 能量,将进入细胞内的药物泵出细胞,从而介导细胞产生耐药性。 研究发现,经放射线照射后肿瘤细胞同样产生多药耐药(multidrug resistance, MDR)现象。P-gp170 不仅存在于肿瘤细胞,在肠道、肝脏、 肾上腺等全身组织均有广泛分布,且具有重要的生理功能。 为抑制肿瘤 MDR,人们进行了大量尝试。理论上,可在 DNA、RAN 和蛋白三个水平阻滞 P-gp170 蛋白的功能发挥。直接针对 P-gp170 的钙 通道阻滞剂维拉帕米和免疫抑制剂环孢霉素 A 等是研究最多的具有逆 转 MDR 作用的化学制剂。然而,其效果并不理想,也无法特异性地作 用于肿瘤细胞。 反义技术可特异性封闭细胞内基因表达,包括运用质粒、病毒等载 体转染细胞,持续性封闭或运用反义寡聚核苷酸瞬时封闭基因。针对 肿瘤细胞的 MDR,多数研究人员运用反义寡核苷酸封闭培养细胞中 mdr1 的表达。然而,反义寡核苷酸在细胞培养环境或血液、组织液中 5 WP=11 重庆医科大学博士学位论文 极易被 DNA 酶降解,高浓度的寡核苷酸对细胞会产生毒性作用,因此 限制了其实际应用价值。 本课题运用反义技术,将编码 mdr1 的 cDNA 序列从起始位点开始 的 200bp 序列反向插入腺病毒载体,使肝癌细胞被腺病毒转染后,反 义 mdr1 得以在细胞内转录,以封闭正义 mdr1 的转录和表达,从而降 低 P-gp170 蛋白翻译,降低癌细胞对化疗药物的耐受。 基因治疗运用于临床最重要的瓶颈问题是基因载体的选择。目前 基因载体大致可分为病毒载体和非病毒载体两大类。最具临床运用前 景的是病毒载体,而重组腺病毒载体具有的独特优势,又使其成为最 受关注的研究热点之一。 基因治疗运用于临床前还必须解决目的基因在体内表达的靶向性 问题。以本实验为例,当 HCC 细胞中 mdr1 基因被封闭后,其对化疗 药物的耐受性将下降,但如果反义基因同时在体内所有细胞中被均等 转录,必然将导致全身细胞对化疗药物耐受的普遍降低,这对于造血 细胞无疑是极其不利的。因此,治疗基因的靶向性表达仍然需要进行 深入研究。 本实验针对 HCC 恶性肿瘤细胞的多药耐药问题,以体外培养的肝 癌 HepG2 细胞为实验对象,采用阿霉素分级诱导,培养出 HepG2 MDR 表型细胞株;基于腺病毒 Adeno-XTM expression system, 我们用从人基 因组克隆的 271 bp 特异甲胎蛋白启动子替换病毒穿梭质粒 pshuttle 的 CMV 启动子,将 mdr1 基因转录起始位点后 200 bp cDNA 片段反向插 6 WP=12 重庆医科大学博士学位论文 入至 pshuttle 多克隆位点(Multiple cloning site, MCS)。构建成携带 mdr1 反义cDNA的靶向腺病毒载体;进而重组腺病毒转染MDR 表型HepG2 细胞,检测其对 MDR 的逆转作用。与此同时,我们还检测了该腺病毒 载体携带基因表达的靶向性。主要实验结果与结论如下: 1. 采用 0.01~2.0 μg/ml 阿霉素分级诱导 AFP 阳性的 HepG2 细胞, 以获得 MDR 表型的耐药 HepG2 细胞株 HepG2R。用免疫细胞化学、 Western blot 检测 P-gp170 的表达;RT-PCR、Northern blot 检测 mdr1 表达水平;MTT 法测定 HepG2 和 HepG2R 细胞在阿霉素、5-FU、紫 杉醇(Taxol)等三?


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