超声波逆转人肿瘤多药耐药的体内实验研究

【摘要】： 研究背景 肿瘤多药耐药现象是肿瘤化学治疗的主要障碍。P-gp的过表达是其主要机制之一。另外，多药耐药相关蛋白（MRP）和肺耐药蛋白（LRP）也是与多药耐药形成相关的质膜蛋白。MRP和P-gp同属于ABC结合盒超家族转运蛋白，依靠ATPase水解供能将许多结构和功能不同的化合物排出细胞而产生多药耐药。与凋亡和抗凋亡有关的基因和蛋白表达的改变，是产生肿瘤多药耐药的另一主要机制。 目前, 降低或逆转肿瘤多药耐药的方法和策略很多，由于其毒、副作用和缺乏组织特异性，使其应用受到很大限制。我们的前期研究发现超声波在体外能降低耐药肿瘤细胞质膜上耐药蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达, 诱导HepG2/ADM细胞株凋亡，逆转肿瘤细胞多药耐药。然而，体内肿瘤的多药耐药受到多种因素的影响，超声波能否在体内逆转肿瘤的多药耐药目前尚不十分清楚。 目的 ⑴ 建立裸鼠HepG2/ADM移植瘤模型及生物学特性评价。 ⑵ 探讨超声波对裸鼠移植瘤生物学特性的影响和逆转裸鼠多药耐药移植瘤的效应。 ⑶ 研究超声波对多药耐药蛋白及其基因表达和Bcl-2和Bax蛋白及其基因表达的影响, 细胞膜上ATPase活性的变化, 探讨超声波逆转肿瘤多药耐药的机制。 ⑷ 探讨超声波逆转多药耐药肿瘤的安全性, 有效性和可行性。 方法 ⑴ 20只裸鼠建立阿霉素耐药株HepG2/ADM动物模型，它们被随机分成两组：HepG2组：10只裸鼠接受皮下注射5×106/ml阿霉素敏感的HepG2细胞；HepG2/ADM组：另外10只皮下注射同样数量的HepG2阿霉素耐药株。观察两组 WP=9 裸鼠肿瘤细胞生物学、形态和组织学改变。MTT法和Western- blot法分析两组裸鼠肿瘤细胞药物敏感性，检测MDR和凋亡相关蛋白表达。应用SAS 8.0软件包作统计分析。 （2）将40只HepG2/ADM裸鼠随机分成4组：分别为对照组(未经任何干预)；ADM组，以5 mg/kg 的ADM注入裸鼠尾静脉；超声组，以超声（0.4302W/cm2, 0.8MHz） 照射裸鼠皮下肿瘤5 minutes; ADM联合超声组,用同上剂量的ADM和超声同时处理。每组10只裸鼠。测量超声治疗区域温度分布；并用光镜和电镜检测治疗区域的组织学改变。检测四组裸鼠肿瘤生长和MDR逆转效果。应用方差分析和t 检验作统计学分析。 （3）将40只HepG2/ADM裸鼠随机分成对照组（10支）、ADM组（20支）、ADM联合超声组（20支）。治疗后28天后采集标本，分别应用Western blot和免疫组化法检测P-gp, MRP, LRP, Bcl-2 和Bax蛋白表达。用TUNNEL法检测裸鼠HepG2/ADM肿瘤细胞凋亡。应用RT-PCR法检测MDR1, MRP, LRP, Bcl-2 和 Bax mRNA表达。用化学发光法检测ATP酶活性。SAS 8.0软件包作统计分析。 结果 1.与HepG2裸鼠移植瘤相比, 裸鼠HepG2/ADM移植瘤缺乏ADM敏感性；同时也存在对MDR相关药物epirubicin, mitoxantrone, vincristine, etoposide和 taxol的交叉耐药；MDR蛋白 (P-gp, MRP and LRP)和Bcl-2蛋白表达也显著增加 2.治疗四周后，同对照组相比，超声组和超声联合ADM组的裸鼠出现肿瘤细胞缩小、膜破坏、染色质浓缩、核片断化和凋亡小体等形态学改变。超声组和联合组分别有2个和3个裸鼠肿瘤包块消失，并且这两组肿瘤生长受到抑制；肿瘤倍增时间显著延长；肿瘤抑制率和生存延长时间明显增加。 3.治疗四周后，应用免疫组化检测发现，同对照组相比，超声组和超声联合ADM组裸鼠移植瘤P-gp, MRP 和Bcl-2蛋白表达明显降低；凋亡细胞明显增加；同时RT-PCR检测发现，MDR1, MRP和 Bcl-2 mRNA表达明显下降；但ATP酶活性活性未见有显著意义的改变。 WP=10 结论 1.应用阿霉素诱导建立的人肝癌多药耐药细胞亚系－HepG2/ADM，以皮下注射法建立的的裸鼠移植瘤，具有肿瘤多药耐药的特性；该模型的建立为探讨获得性肿瘤多药耐药机制，研究临床逆转肿瘤多药耐药提供了理想的动物模型。 2.超声波能够在体内逆转肿瘤多药耐药；应用超声治疗裸鼠多药耐药移植瘤，可延长裸鼠生存期；超声波可增强ADM体内逆转肿瘤多药耐药的效果。空化和机械机制可引起肿瘤细胞超微结构改变和诱导其凋亡，参与超声逆转多药耐药的生物学效应。 3.治疗超声波用于体内逆转肿瘤多药耐药安全有效可行。多种机制参与超声逆转多药耐药，包括： 超声增加细胞对药物的摄取，而增加对化疗药物敏感性。 超声可抑制ATPase活性，并通过降低 mdr1 和 mrp 基因表达，抑制其功能。 超声可通过降低bcl-2基因表达诱导体内MDR肿瘤细胞凋亡。