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氨基甘露聚糖的制备、理化性质及应用的研究

李宏涛  
【摘要】:目的:人工合成一种表面带阳性电荷的高分子材料——氨基甘露聚糖(Aminoglucomannan,AGM)。研究其分子量、紫外-可见吸收光谱、电导率等物理和化学性质,及与核酸(质粒DNA等)在一些作用因素影响下的聚合过程,并将二者聚合的复合物进行体外HEK239细胞转染实验,评价AGM作为基因治疗载体的有效性及安全性。希望能够开发一种安全有效的非病毒基因载体。 方法:1. AGM的合成:配制甘露聚糖(GM)水溶液,乙醇沉淀后,去离子水复溶。取20mL该溶液,加入不同比例的氨水,超声波催化产生氨解反应,获得不同程度氨基化的AGM;2. AGM理化性质的检测:(1)用高效液相色谱法分析GM和AGM的纯度和分子量;(2)在光学显微镜下观察AGM形成的颗粒;(3)用电导仪测定其电导率、可溶性固体总量(TSD)及盐度;(4)用紫外-可见分光光度仪扫描GM、AGM及氨水等,观察其最大吸收波长;3. AGM和质粒DNA聚合的研究:用琼脂糖电泳法观察质粒DNA条带形态及移动的变化,研究二者聚合形成复合物的能力。主要包括:AGM的浓度、氨基化程度、pH值及溶液的NaCl对该聚合过程的影响,以及NaCl对该复合物稳定性的影响。另外还研究了将AGM进行预加热后与质粒聚合的能力;4. WP=8 AGM细胞毒性的检测:用含1.25%-10%(v/v)AGM的培养液培养HEK293细胞,培养48h后,用MTT法检测各组的吸光度,用t检验进行比较;5. AGM- pEGFP-C1复合物的细胞转染作用:使用HEK293细胞进行细胞转染实验,设立五组:A:预加热组、B:后加热组、C:非加热组、D:质粒对照组和E:阳性对照组。在A、B和C组包括30μL、20μL、10μL和5μL /孔四种体积的AGM和0.5μg质粒pEGFP-C1聚合,分别将这些复合物转染HEK293细胞。观察细胞内绿色荧光蛋白的表达情况;6. AGM-转运寡核苷酸的细胞转染作用:将荧光试剂罗丹明标记的寡核苷酸和AGM聚合后,加入HEK293细胞中培养,用荧光显微镜观察细胞内的红色荧光点。 结果: 1. AGM的理化性质:(1)AGM可自聚成各种的颗粒,氨基化程度越高颗粒越大;(2)其电导率、TDS较未氨基化前升高近30倍;加入的氨少,得到的AGM的电导率、TDS低;(3)纯度和分子量: GM和AGM的保留时间相近,均为单一主峰,纯度分别为100%和93.5%;二者的分子量约80,000 D左右;(4)紫外-可见光谱:AGM的吸收峰在λmax=209nm,峰形“拖尾”,其波长接近氨水(λmax=207nm),峰形甘露聚糖(λmax=192nm)的相似;2. AGM和质粒DNA的聚合实验结果:(1)和质粒对照比较,AGM和质粒复合物在凝胶电泳上表现为新的泳动较慢的条带、质粒条带消失或滞留在上样孔。浓度越高或氨基化程度高的AGM的结果越明显;(2)二者聚合的最适pH 在6-7时;(3)AGM溶液中的NaCl越低,复合物的形成越多,并且复合物 WP=9 的稳定性越好;(4)AGM经过80℃加热1-2h后,其DNA聚合能力降低或消失;3. AGM的细胞毒性:含2.5%~10%(v/v)的AGM组的OD490值略高于空白对照组,p<0.01;4. AGM将pEGFP-C1转染到细胞,并表达GFP: 转染后,在荧光显微镜下,200倍视野中观察并计数每组的绿色荧光点:A组:3±0.8;B组:6±1.5;C组: 12.2±2.1;D组: 0.5±0.1;E组:30±4.6。实验组的GFP出现较阳性对照晚,可持续20d;5. AGM将寡核苷酸转入HEK293细胞内:5-24h即可观察到HEK293细胞内出现大量的红色荧光点。 结 论: 1.自行制备的AGM表面具有阳性电荷,具有自聚的特性;2.在适当的条件下,AGM可以和质粒DNA聚合;3.作为基因载体,AGM能有效地将pEGFP-C1和寡核苷酸导入HEK239细胞。4. AGM对HEK293细胞无毒性;反而有促进细胞生长的作用。


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